Генерация клеточной линии RIP1 Knockout U937 с использованием системы CRISPR-Cas9

Резюме

По мере того, как протоколы, связанные с CRISPR, становятся все более полезными и доступными, при определенных экспериментальных условиях все еще могут возникать осложнения и препятствия. В этом протоколе описывается создание рецептор-взаимодействующей линии серин/треонин-протеинкиназа 1 (RIPK1/RIP1) с нокаутной линией клеток человека с использованием CRISPR/Cas9 и освещаются потенциальные проблемы, возникающие в ходе этого процесса.

Аннотация

В этом протоколе описана процедура нокаутирования гена RIP1 с помощью CRISPR/Cas9 в клеточной линии U937 моноцита человека. В методе используются назначенные направляющие РНК-плазмиды и лентивирусные упаковочные плазмиды для достижения нокаута гена RIP1. Протокол решает проблемы и совершенствует традиционные методы CRISPR, позволяя воспроизводить его для будущих исследований клеточной смерти. Полученные мутантные клетки могут быть использованы для исследования механистических изменений в клеточной смерти, где в противном случае функциональные белки RIP1 играли бы роль. Анализы жизнеспособности показали значительное снижение гибели клеток в нокаутных клетках после индукции некроптоза. Флуоресцентная микроскопия выявила заметное снижение митохондриальных активных форм кислорода (АФК) в нокаутных клетках при тех же условиях. В совокупности эти функциональные анализы подтверждают потерю белка RIP1. Оптимизированная для использования с человеческими моноцитами U937, эта процедура также может быть адаптирована для нацеливания на другие ключевые регуляторы клеточной смерти, получая функциональные, нелетальные мутанты. Потенциальные подводные камни рассматриваются на всех этапах, чтобы дать представление о проблемах, которые могут возникнуть во время генерации мутантов.

Введение

Использование технологии редактирования генов CRISPR/Cas9 стремительно развивалось с момента ее открытия ^1,2,3. Способность нокаутировать или нокаутировать гены в клеточных линиях или бактериях неоценима для дальнейших исследований и понимания внутриклеточных механизмов 1,2,3,4,5,6. Система CRISPR-Cas9 улучшает предыдущие методы редактирования генов, такие как активатор-эффекторная нуклеаза транскрипции (TALEN), упрощая инженерию генной специфичности. Эта процедура включает в себя два фундаментальных компонента: направляющую РНК (гРНК), используемую для определения местоположения предполагаемой генной мишени, и Cas9, которая представляет собой эндонуклеазу, которая изменяет предполагаемое местоположение генома с помощью двухцепочечного разрыва ДНК ^3,4. ГРНК будет действовать как проводник для эндонуклеазы Cas9, чтобы найти и инициировать двухцепочечный разрыв в предполагаемой генетической последовательности посредством спаривания оснований Уотсона-Крика. Полный процесс редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 включает в себя клеточный механизм, восстанавливающий эти двухцепочечные разрывы в ДНК посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной рекомбинации ^3,7. Более вероятно, что произойдет NHEJ, что приведет к изменению в геноме, что приведет к потере экспрессии целевого гена ^3,4.

Коммерческие источники смогли создать библиотеки мишеней гРНК, которые могут экспрессироваться посредством роста и выделения бактерий, что значительно повышает удобство их использования. Однако основным ограничением системы CRISPR/Cas9 является сложность доставки комплекса гРНК и Cas9 в целевые клеточные линии. Эти ограничения возникают в суспензионных клеточных линиях, поскольку их обычно называют труднотрансфективными⁸. Типичные методы трансфекции, как правило, не эффективны в доставке системы CRISPR/Cas9 в суспензионные клетки, поэтому методы доставки вирусов, такие как лентивирусная трансфекция и трансдукция, лучше подходят для этого типа клеточной линии ^8,9.

Для этого типа трансфекции требуется лентивирусный вектор, который кодирует гРНК и эндонуклеазу Cas9 вместе с добавлением лентивирусных упаковочных плазмид, которые трансфицируются в клеточную линию, способную производить лентивирусные частицы. Обычно для этого процесса выбирают клеточную линию HEK293T клеток, так как они легче поддаются трансфекции и очень эффективно работают при сборке гРНК и Cas9 ^9,10. Затем эти частицы высвобождаются в виде лентивирусов в надосадочную жидкость, которая может быть использована для трансдукции гРНК и Cas9 в предполагаемую суспензию клеточной линии, такую как моноциты человека U937. Таким образом, описанная здесь процедура имеет следующие изменения по сравнению с установленными методами: (1) Альтернативный метод трансфекции для труднотрансфицируемых клеточных линий; (2) Нет необходимости концентрировать плазмидную ДНК CRISPR или использовать ультрацентрифугу; и (3) устраняет необходимость в клонировании одиночных клеток.

Непосредственной целью данной статьи было нокаут гена RIP1 в моноцитах человека U937. Каноническая форма высоковоспалительного некроптоза пути клеточной смерти контролируется RIP1, который служит ключевой мишенью для исследований клеточной смерти. 11,12,13,14 По мере того, как RIP1 становится активным посредством аутофосфорилирования, он затем рекрутирует и вызывает прямое фосфорилирование и активацию рецептор-взаимодействующей серин/треонин-протеинкиназы 3 (RIPK3/RIP3) и псевдокиназы смешанной линейной киназы (MLKL) для образования некросомы. После этого образования некросома может свободно перемещаться по всей клетке, взаимодействуя с органеллами, такими как митохондрии^12,13. В митохондриях RIP1 потенцирует петлю положительной обратной связи с клеточным метаболизмом, непосредственно влияя на производство митохондриальных АФК, что, в свою очередь, способствует дальнейшему аутофосфорилированию RIP1, образованию некросом и последующему выполнению некроптоза 11,12,13,14.

В то время как в центре внимания нынешней исследовательской группы находится роль RIP1 в гибели клеток, другие причины для изучения RIP1 включают его роль в воспалении и инфекции. После активации рецепторами смерти, такими как рецепторы TNF, RIP1 способствует активации сигнального пути NF-kB, который запускает транскрипцию провоспалительных цитокинов, хемокинов и других молекул, необходимых для рекрутирования иммунных клеток и усиления воспалительной^{реакции}. В дополнение к активации NF-κB, RIPK1 также может задействовать сигнальные пути MAPK, еще больше усиливая воспаление^15,16. Что касается его роли в ответе на инфекцию, RIP1 действует как ключевой медиатор воспалительной реакции хозяина, особенно в ответ на патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), распознаваемые рецепторами распознавания образов (PRR), такими как Toll-подобные рецепторы (TLR)¹⁷. Более того, во время сепсиса RIP1 активируется путем передачи сигналов через рецепторы смерти, такие как рецептор TNF, что приводит к инициированию провоспалительных каскадов. RIPK1 опосредует активацию путей NF-κB и MAPK, способствуя выработке провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-1β и IL-6, которые являются ключевыми факторами системной воспалительной реакции, характерной для сепсиса¹⁸.

протокол

Схематическое изображение процедуры представлено на рисунке 1. Направляющая РНК (гРНК) и последовательность-мишень приведены в таблице 1. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Сбор RIP1-нацеленного на CRISPR вектора экспрессии лентивируса гРНК, содержащего эндонуклеазу Cas9 и резистентность к пуромицину у Escherichia coli

1. Квадрантная полоса E. coli, содержащая лентивирусную векторную гРНКна пластинах LB-агара, дополненная 100 мкг/мл ампициллина.
2. Инкубируйте планшеты при температуре 37°C в течение 1-2 дней, пока отдельные колонии не станут видны в наиболее разбавленном участке планшета.
3. Выберите одну колонию со стерильной петлей и по отдельности добавьте каждую колонию в 5 мл бульона LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в коническую пробирку объемом 50 мл. Убедитесь, что после добавления одной колонии вы тщательно пипетируете вверх и вниз, чтобы обеспечить гомогенизацию.
4. Прокрутите и заклейте скотчем колпачок конической трубки объемом 50 мл и инкубируйте в орбитальном вибростенде при температуре 37°C и 225 об/мин в течение 8 часов.
5. Во время 8-часовой инкубации при 37°C добавьте 40 мл бульона LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в каждую из четырех отдельных конических пробирок объемом 50 мл.
6. После 8-часовой инкубации при 37°C возьмите 40 μл выращенного E. Культуру кишечной палочки и добавить ее во все четыре конические пробирки по 50 мл.
7. Прокрутите и заклейте скотчем крышки конических пробирок объемом 50 мл и инкубируйте их в орбитальном вибростенде при температуре 37°C и 225 об/мин в течение 12-16 часов.
8. После этой инкубации при 37 °C вращайте все пробирки при 3220 x g в качающемся роторе ковша в течение 20 минут, чтобы гранулировать выращенные бактерии E. coli .
9. Сцедите надосадочную жидкость в стакан для отходов, затем смешайте все четыре гранулы в 10 мл бульона LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина.
10. Снова вращайте комбинированные гранулы с максимальной скоростью в качающемся роторе ковша в течение 20 минут, чтобы получить одну гранулу.
11. Выбросьте как можно больше надосадочной жидкости в стакан для отходов и выберите один из следующих вариантов: (1) Заморозьте влажные гранулы при температуре -80° на срок до 1 месяца. (2) Приступайте к очистке плазмид лентивирусным вектором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбран вариант 1, протокол может быть приостановлен здесь.

2. Трансфекция HEK293T клеток очищенным вектором экспрессии лентивируса CRISPR гРНК, нацеленным на RIP1

1. Семена HEK293T клетки в течение ночи в концентрации от 3 ×^{10 6} до 5 × 10⁶ клеток в 10-сантиметровую пластину, содержащую DMEM с 4,5 г/л D-глюкозы, L-глутамина, 110 мг/л пирувата натрия и 10 % термоинактивированного FBS.
2. На следующий день убедитесь, что пластины имеют примерно 70%-90% конфлюенции, затем следуйте протоколу.
3. Организуйте трансфекцию клеток с соотношением плазмид 1:1:1:1 (экспериментальная плазмида CRISPR: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) с использованием реагента для трансфекции в соотношении 3:1 (3 части реагента: 1 часть плазмидной ДНК), вместе с восстановленной сывороточной средой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часть соотношения pLP1: pLP2: pLP/VSVG представляет собой лентивирусную упаковочную смесь.
   1. Уравновесьте реагент для трансфекции, восстановленную сывороточную среду, плазмидную ДНК CRISPR и упаковочную смесь лентивируса до комнатной температуры перед началом трансфекции.
   2. Смешайте 75 мкл реагента для трансфекции, 2500 мкл восстановленной сывороточной среды и 25 мкг общей ДНК (расчет основан на спектрофотометрическом анализе плазмидной ДНК CRISPR и соотношении 1:1:1:1 с упаковочной смесью лентивируса).
   3. Дайте этой смеси понервироваться при комнатной температуре в течение 15-30 минут. Аккуратно дозатором направьте весь объем этой смеси на сливающуюся HEK293T клеточную пластину прямо в среду (не нужно менять среду).
4. Аккуратно поворачивайте пластину, чтобы обеспечить достаточную гомогенизацию трансфекционной смеси и среды для пластин. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 48 часов.

3. Лентивирусная трансдукция клеток U937 или клеток-мишеней

1. После завершения 48-часовой инкубации при температуре 37 ^°C перенесите среду из продуцента HEK293T клеточную пластину в коническую пробирку объемом 15 мл.
2. Центрифугируйте в объеме 800 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать все оставшиеся HEK293T ячейки. Удалите всю вирусосодержащую надосадочную жидкость, стараясь не потревожить гранулированные HEK293T клетки, и храните ее в отдельной конической пробирке объемом 15 мл. Затем обеззаритите и выбросьте содержащую гранулы пробирку в соответствующий контейнер для биологически опасных отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Надосадочные жидкости на основе лентивируса на основе ВИЧ могут храниться при температуре -80°С; Однако это сопряжено с риском потери стабильности вируса до 55% после первого цикла замораживания/оттаивания¹⁹.
3. Подсчитайте и получите гранулу из 2 × 10⁶ U937 клеток в конической пробирке объемом 15 мл путем центрифугирования соответствующего объема при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и сцедите надосадочную жидкость, оставив клеточную гранулу в пробирке.
4. Повторно суспендируйте клеточную гранулу U937 со всем вируссодержащим надосадочным веществом, а затем центрифугируйте пробирку при давлении 290 x g в течение 60 минут.
5. После центрифугирования с помощью пипетки повторно суспендируйте гранулу с вируссодержащим надосадочной жидкостью, уже находящейся в пробирке.
6. Поместите трубку на вращатель «конец над концом» (или аналогичное вращающееся устройство) на 60 минут.
   1. После этой инкубации центрифугируйте пробирки при давлении 400 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки.
   2. Ресуспендируйте клеточную гранулу смесью сред в соотношении 1:1, состоящей как из вируссодержащих надосадочных веществ, так и из полной среды RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированного при нагревании FBS.
7. Переложите клеточную смесь на 10-сантиметровый планшет для культуры тканей и инкубируйте при 37°C в течение 48 часов.
8. После этой инкубации центрифугируйте клетки U937 при давлении 400 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость.
   1. Повторно суспендируйте гранулу с полным фильтрующим материалом RPMI-1640 с добавлением 10% термоинактивированного FBS и 5 мкг/мл пуромицина, и перенесите элементы в колбу T25.
   2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C нетронутыми в течение 2-3 недель, проверяя их каждые 1-2 дня на наличие признаков роста клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только клетки сливаются и имеют здоровое время обновления после первоначального пассажа, они могут быть проверены на эффективность завершенного протокола.

4. Тестирование эффективности готового протокола при создании мутантных клеток RIP1 CRISPR с помощью вестерн-блоттинга

1. Получение клеточных белковых лизатов моноцитов дикого типа (WT) U937, нецелевых контрольных (NTC) CRISPR клеток и мутантных клеток RIP1 CRISPR 11,12,13.
2. Запустите эти лизаты на геле SDS-PAGE и приступайте к анализу вестерн-блоттинга¹⁴.
   1. Сначала нормализуйте образцы до бытового белка.
   2. После нормализации проанализируйте образцы на уровни экспрессии белка RIP1, чтобы адекватно определить успех создания мутантной клеточной линии RIP1 CRISPR¹⁴.
3. После проведения вестерн-блоттинга клетки могут быть использованы в экспериментальных целях.

Результаты

После получения конфлюентной популяции мутантных клеток U937 RIP1 CRISPR были проведены SDS-PAGE и вестерн-блоттинг. Вестерн-блоттинг был использован для определения успешного создания мутантной клеточной линии RIP1 CRISPR путем оценки потери уровней экспрессии белка RIP1....

Обсуждение

Этот протокол направлен на предоставление подробных инструкций и анализ потенциальных подводных камней в эффективности и надежности лентивирусной трансфекции и трансдукции для создания клеточной линии U937 с нокаутом RIP1. Несмотря на то, что этот метод трансфекц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902