CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 RIP1 Knockout U937 세포주 생성

요약

CRISPR 관련 프로토콜이 점점 더 유용해지고 접근성이 높아짐에 따라 특정 실험 조건에서 복잡성과 장애물이 여전히 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9을 사용하여 수용체 상호 작용 세린/트레오닌-단백질 키나아제 1(RIPK1/RIP1) 녹아웃 인간 세포주를 생성하는 방법을 간략하게 설명하고 이 과정에서 직면할 수 있는 잠재적인 문제를 강조합니다.

초록

이 프로토콜은 인간 단핵구 U937 세포주에서 CRISPR/Cas9을 사용하여 RIP1 유전자를 knockout하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 방법은 지정된 가이드 RNA 플라스미드와 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 사용하여 RIP1 유전자 knockout을 달성합니다. 이 프로토콜은 기존 CRISPR 방법의 문제점과 개선 사항을 해결하여 향후 세포 사멸 연구를 위한 복제를 가능하게 합니다. 그 결과로 생성된 돌연변이 세포는 기능적 RIP1 단백질이 다른 역할을 하는 세포 사멸의 기계론적 변화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 생존력 분석은 괴사 유도 후 녹아웃 세포에서 세포 사멸을 현저히 감소시키는 것으로 나타났습니다. 형광 현미경 검사는 동일한 조건에서 녹아웃 세포에서 미토콘드리아 활성 산소 종(ROS)의 현저한 감소를 보여주었습니다. 이러한 기능 분석법은 함께 RIP1 단백질의 손실을 확인합니다. U937 인간 단핵구와 함께 사용하도록 최적화된 이 절차는 다른 주요 세포 사멸 조절자를 표적으로 하도록 조정하여 기능적이고 치명적이지 않은 돌연변이를 생성할 수도 있습니다. 돌연변이 생성 중에 발생할 수 있는 문제에 대한 통찰력을 제공하기 위해 잠재적인 함정이 전체적으로 해결됩니다.

서문

CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술의 사용은^{발견 1,2,3} 이후 빠르게 발전해 왔습니다. 세포주 또는 박테리아 내에서 유전자를 knock-in하거나 knockout하는 능력은 연구를 진행하고 세포 내 메커니즘에 대한 이해를 촉진하는 데 매우 중요합니다 1,2,3,4,5,6. CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 특이성 엔지니어링을 단순화하여 전사 활성제 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)와 같은 이전 유전자 편집 방법을 개선합니다. 이 절차에는 두 가지 기본 구성 요소가 포함됩니다: 의도된 유전자 표적을 찾는 데 사용되는 가이드 RNA(gRNA)와 이중 가닥 DNA 단절 ^3,4로 의도된 게놈 위치를 수정하는 엔도뉴클레아제인 Cas9. gRNA는 Cas9 엔도뉴클레아제가 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 의도한 유전자 염기서열에서 이중 가닥 절단을 찾고 시작하기 위한 가이드 역할을 합니다. CRISPR/Cas9 시스템에 의한 게놈 편집의 전체 프로세스에는 비상동 말단 결합(NHEJ) 또는 상동 재조합(homologous recombination)을 통해 DNA의 이중 가닥 절단을 복구하는 세포 기계가 포함됩니다 ^3,7. NHEJ가 발생할 가능성이 더 높으며, 게놈에 돌연변이를 효과적으로 생성하여 표적 유전자의 발현 상실을 초래합니다 ^3,4.

상용 소스는 박테리아 성장 및 분리를 통해 발현될 수 있는 gRNA 타겟 라이브러리를 생성할 수 있었으며, 이는 사용 편의성을 크게 향상시킵니다. 그러나 CRISPR/Cas9 시스템의 주요 한계는 gRNA 및 Cas9 복합체를 타겟 세포주에 전달하기 어렵다는 것입니다. 이러한 한계는 일반적으로 hard-to-transfection으로 지칭되는 현탁 세포주에서 발생합니다⁸. 일반적인 transfection 방법은 일반적으로 CRISPR/Cas9 시스템을 suspension cell에 전달하는 데 효율적이지 않기 때문에 lentiviral transfection 및 transduction과 같은 바이러스 전달 방법이 이러한 유형의 세포주에 더 적합합니다 ^8,9.

이러한 유형의 transfection에는 gRNA 및 Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터와 렌티바이러스 패키징 플라스미드가 필요하며, 이는 렌티바이러스 입자를 제조할 수 있는 세포주로 transfection됩니다. 이 과정에서 일반적으로 선택되는 세포주는 HEK293T세포인데, 이는 세포가 형질주입이 쉽고 gRNA와 Cas9 ^9,10의 조립에서 매우 효율적으로 작용하기 때문입니다. 그런 다음 이러한 입자는 렌티바이러스로 상층액으로 방출되며, 이는 gRNA 및 Cas9를 U937 인간 단핵구와 같은 의도된 현탁 세포주로 형질전환시키는 데 사용할 수 있습니다. 이와 같이, 여기에 설명된 절차는 확립된 방법과 비교하여 다음과 같은 변경 사항이 있습니다: (1) transfection이 어려운 세포주에 대한 대체 transfection 방법; (2) CRISPR 플라스미드 DNA를 농축하거나 초원심분리기를 사용할 필요가 없습니다. (3) 단일 세포 클로닝의 필요성을 제거합니다.

이 논문의 직접적인 초점은 U937 인간 단핵구에서 RIP1 유전자를 녹아웃하는 것이었습니다. 염증성이 높은 세포 사멸 경로 괴사(cell death pathway necroptosis)의 표준 형태는 세포 사멸 연구의 중추적인 표적 역할을 하는 RIP1에 의해 제어됩니다. ^11,12,13,14 RIP1이 자가인산화를 통해 활성화되면, 수용체 상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나아제 3(RIPK3/RIP3) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL) 슈도키나아제를 모집하여 직접 인산화 및 활성화를 일으켜 네크로솜을 형성합니다. 이 형성에 따라 괴사체는 세포 전체를 자유롭게 이동하여 미토콘드리아^12,13와 같은 세포 기관과 상호 작용합니다. 미토콘드리아에서 RIP1은 세포 대사와 함께 긍정적 인 피드백 루프를 강화하여 미토콘드리아 ROS의 생성에 직접적인 영향을 미치고, 이는 차례로 RIP1의 추가 자가인산화, 괴사 형성 및 괴사증 11,12,13,14의 다운스트림 실행을 촉진합니다.

현재 연구 그룹의 초점은 세포 사멸에서 RIP1의 역할이지만, RIP1을 연구하는 다른 이유에는 염증 및 감염에 대한 역할도 포함됩니다. TNF 수용체와 같은 사멸 수용체에 의해 활성화되면, RIP1은 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 촉진하여 면역세포 동원에 필수적인 전염증성 사이토카인, 케모카인 및 기타 분자의 전사를 유발하고 염증 반응의 증폭을 촉진합니다¹⁵. NF-κB 활성화 외에도 RIPK1은 MAPK 신호 경로에 관여하여 염증을 더욱 강화할 수 있습니다^15,16. 감염에 대한 반응에서의 역할과 관련하여, RIP1은 숙주 염증 반응의 중추적인 매개체 역할을 하며, 특히 톨 유사 수용체(TLR)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 인식되는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)에 대한 반응으로 작용합니다¹⁷. 더욱이, 패혈증이 진행되는 동안 RIP1은 TNF 수용체와 같은 사멸 수용체를 통한 신호에 의해 활성화되어 전염증성 폭포(pro-inflammatory cascades)를 시작합니다. RIPK1은 NF-κB 및 MAPK 경로의 활성화를 매개하여 패혈증¹⁸의 전신 염증 반응의 핵심 동인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 촉진합니다.

프로토콜

절차의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 가이드 RNA(gRNA) 및 타겟 염기서열은 표 1에 나와 있습니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 대장균에서 Cas9 엔도뉴클레아제 및 퓨로마이신 내성을 포함하는 CRISPR gRNA 렌티바이러스 발현 벡터를 표적으로 하는 RIP1 수확

1. 100 μg/mL 암피실린이 보충된 LB 한천 플레이트에 렌티바이러스 벡터 gRNA를 품고 있는 사분면 줄무늬 대장균.
2. 플레이트의 가장 희석된 영역에서 개별 콜로니가 보일 때까지 37°C에서 1-2일 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 멸균 루프가 있는 단일 콜로니를 선택하고 각 콜로니를 50mL 원뿔형 튜브에 100μg/mL 암피실린이 보충된 5mL의 LB 육수에 개별적으로 추가합니다. 균질화를 보장하기 위해 단일 콜로니를 추가한 후 위아래로 철저히 피펫팅하십시오.
4. 50mL 코니컬 튜브의 캡을 환기시키고 테이프로 감은 다음 37°C 및 225rpm의 오비탈 셰이커에서 8시간 동안 배양합니다.
5. 37°C에서 8시간 배양 동안 100μg/mL 암피실린이 보충된 LB 육수 40mL를 4개의 개별 50mL 원뿔형 튜브 각각에 추가합니다.
6. 37°C에서 8시간 배양 후 성장한 E 40μL를 취합니다 . 대장균 배양액을 넣고 4개의 50mL 코니컬 튜브 모두에 추가합니다.
7. 50mL 코니컬 튜브의 캡을 환기시키고 테이프로 감아 37°C 및 225rpm의 오비탈 셰이커에서 12-16시간 동안 배양합니다.
8. 37°C에서 배양한 후 스윙 버킷 로터에서 3220 x g 의 모든 튜브를 20분 동안 회전시켜 성장한 대장균 박테리아를 펠릿화합니다.
9. 상등액을 폐기물 비커에 디캔팅한 다음 100μg/mL 암피실린이 보충된 10mL의 LB 육수에 4개의 펠릿을 모두 결합합니다.
10. 20분 동안 흔들리는 버킷 로터에서 결합된 펠릿을 최대 속도로 다시 회전시켜 단일 펠릿을 얻습니다.
11. 가능한 한 많은 상등액을 폐기물 비커에 버리고 다음 옵션 중 하나를 진행하십시오.: (1) 젖은 펠릿을 -80°에서 최대 1개월 동안 그대로 동결합니다. (2) 렌티바이러스 벡터 플라스미드 정제를 진행한다.
    참고: 옵션 1을 선택하면 여기에서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다.

2. RIP1을 타겟으로 하는 정제된 CRISPR gRNA 렌티바이러스 발현 벡터를 사용한 HEK293T세포 transfection

1. 3 ×^{10 6} × 5 10⁶ 세포의 농도로 HEK293T 세포를 4.5 g/L D-글루코오스, L-글루타민, 110 mg/L 피루브산 나트륨 및 10 % 열 비활성화 FBS가 포함된 DMEM이 포함된 10cm 플레이트에 하룻밤 동안 파딩합니다.
2. 다음 날, 플레이트의 밀도가 약 70%-90%인지 확인한 다음 프로토콜을 진행합니다.
3. 1:1:1:1 비율의 플라스미드(실험용 CRISPR 플라스미드: pLP1: pLP2: pLP/VSVG)와 함께 3:1 비율(3 시약: 1 파트 플라스미드 DNA)과 함께 환원된 혈청 배지를 사용하여 세포의 transfection을 설정합니다.
   참고: 비율의 pLP1: pLP2: pLP/VSVG 부분은 렌티바이러스 패키징 혼합물입니다.
   1. transfection 설정 전에 transfection 시약, 환원된 혈청 배지, CRISPR 플라스미드 DNA 및 렌티바이러스 패키징 혼합물을 실온으로 평형을 이룹니다.
   2. 75 μL의 transfection 시약, 2500 μL의 환원된 혈청 배지 및 25 μg의 총 DNA를 함께 혼합합니다(CRISPR 플라스미드 DNA에 대한 분광광도계 분석 및 렌티바이러스 패키징 혼합물을 사용한 1:1:1:1 비율에 기반한 계산).
   3. 이 혼합물을 실온에서 15-30분 동안 배양합니다. 이 혼합물의 전체 부피를 배지에 바로 합류 HEK293T 세포 플레이트로 조심스럽게 피펫팅합니다(배지를 변경할 필요 없음).
4. 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 transfection mix와 플레이트 배지의 적절한 균질화를 보장합니다. 플레이트를 37 ° C에서 48 시간 동안 배양합니다.

3. U937 세포 또는 표적 세포의 렌티바이러스 형질도입

1. 37^°C 에서 48시간 배양이 완료되면 생산자 HEK293T 세포 플레이트의 배지를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
2. 실온에서 800 x g 의 부피를 5분 동안 원심분리하여 남아 있는 HEK293T 세포를 펠릿화합니다. 펠릿화된 HEK293T 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 바이러스를 함유한 모든 상등액을 제거하고 별도의 15mL 원뿔형 튜브에 보관하십시오. 그런 다음 오염을 제거하고 펠릿 함유 튜브를 적절한 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리십시오.
   참고: HIV 기반 렌티바이러스 상등액은 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나 그렇게 하면 첫 번째 동결/해동 주기¹⁹ 이후 바이러스 안정성이 최대 55%까지 손실될 위험이 있습니다.
3. 실온에서 400 x g에서 10분 동안 적절한 부피를 원심분리하고 상등액을 디캔팅하여 15mL 코니컬 튜브에서 2 × 10⁶ U937 세포의 펠릿을 계수하고 얻습니다.
4. U937 세포 펠릿에 바이러스가 함유된 모든 상등액을 다시 부유시킨 다음 290 x g 에서 60분 동안 튜브를 원심분리합니다.
5. 원심분리 후 피펫을 사용하여 이미 튜브에 있는 바이러스 함유 상등액과 함께 펠릿을 재현탁합니다.
6. 튜브를 종단 간 회전자(또는 유사한 회전 장치)에 60분 동안 놓습니다.
   1. 이 배양 후 실온에서 10분 동안 400 x g 의 튜브를 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
   2. 바이러스 함유 상등액과 10% 열 불활성화 FBS가 보충된 완전한 RPMI-1640 배지의 1:1 비율 배지 혼합물로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
7. 세포 혼합물을 10cm 조직 배양 플레이트에 옮기고 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
8. 이 배양 후 U937 세포를 400 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
   1. 10% 열 비활성화 FBS와 5μg/mL의 퓨로마이신이 보충된 완전한 RPMI-1640 배지로 펠릿을 재현탁하고 세포를 T25 플라스크로 옮깁니다.
   2. 37 °C에서 2-3주 동안 손대지 않은 상태로 세포를 배양하고 1-2일마다 세포 성장 징후를 확인합니다.
      참고: 세포가 합류하고 초기 통과 후 건강한 전환 시간을 갖게 되면 완료된 프로토콜의 효과를 테스트할 수 있습니다.

4. 웨스턴 블롯 분석을 이용한 RIP1 CRISPR 돌연변이 세포 생성에서 완성된 프로토콜의 효과 테스트

1. 야생형(WT) U937 단핵구, 비표적 대조군(NTC) CRISPR 세포 및 RIP1 CRISPR 돌연변이 세포 11,12,13의 세포 단백질 용해물을 생성합니다.
2. SDS-PAGE 겔에서 이러한 용해물을 실행하고 웨스턴 블롯 분석¹⁴을 진행합니다.
   1. 먼저 샘플을 하우스키핑 단백질로 정규화합니다.
   2. 정규화 후 RIP1 단백질 발현 수준에 대한 샘플을 분석하여 RIP1 CRISPR 돌연변이 세포주¹⁴의 성공 여부를 적절하게 판단합니다.
3. 웨스턴 블롯 분석 형태에 따라 세포를 실험 목적으로 사용할 수 있습니다.

결과

RIP1 CRISPR 돌연변이 U937 세포의 합류 집단을 생산한 후 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 웨스턴 블롯 분석은 RIP1 단백질 발현 수준의 손실을 평가하여 RIP1 CRISPR 돌연변이 세포주의 성공적인 생성을 결정하는 데 사용되었습니다. 이 결정은 WT U937 단핵구와 NTC 세포의 비교 결과를 기반으로 이루어졌습니다. 그림 2에서 RIP1의 발?...

토론

이 프로토콜은 RIP1 knockout U937 세포주를 생성하기 위해 렌티바이러스 transfection 및 transduction의 효율성과 신뢰성에 대한 잠재적 함정에 대한 자세한 지침과 분석을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이러한 transfection 및 transduction 방법은 힘들고 시간이 많이 걸리지만, 일반적으로 선택한 gRNA 및 Cas9 endonuclease를 transfection이 어려운 세포주에 통합하는 효율적인 방법으로 간...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902