الفحص غير الجراحي لتحديد حركية التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة التخليق من أرابيدوبسيس

Summary

هنا ، نصف أداة متقدمة مصممة لمراقبة التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة الشتلات من أرابيدوبسيس . توفر المنهجية الجديدة تصويرا غير جراحي مضان الكلوروفيل في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية.

Abstract

التخليق الحيوي للكلوروفيل هو السمة المميزة لإزالة الاتساق ، وهي واحدة من أكثر المراحل دراماتيكية في دورة حياة النبات. يتم تشغيل عملية التخليق الحيوي للكلوروفيل التي يتم التحكم فيها بإحكام وديناميكية للغاية أثناء التحول من الظلام إلى الضوء في النباتات المزهرة. في الوقت الذي تتعرض فيه الشتلات المعزولة للآثار الأولى لأشعة الشمس ، يتم التحويل السريع (بترتيب ثوان) للبروتوكلوروفيليد إلى الكلوروفيليد بواسطة مجمعات بروتينية فريدة تقبل الضوء ، مما يؤدي عبر خطوات التمثيل الغذائي اللاحقة إلى إنتاج الكلوروفيل الذي يعمل بكامل طاقته. تشمل التقنيات القياسية لتحليل محتوى الكلوروفيل استخراج الصباغ من الأنسجة النباتية المنفصلة ، والتي لا تنطبق على دراسة مثل هذه العمليات السريعة. للتحقيق في حركية الكلوروفيل في الجسم الحي بدقة عالية ودقة مكانية زمانية في الساعات الأولى بعد إزالة العدوى المستحثة بالضوء ، تم تطوير أداة وبروتوكول. نقدم هنا إجراء مفصلا مصمما للقياس الكمي القوي إحصائيا للكلوروفيل في المراحل المبكرة من إزالة الأرابيدوبسيس .

Introduction

يمثل إزالة الاتباع المرحلة الأكثر دراماتيكية في دورة حياة النبات ، والتي تتميز بعدد من التغيرات المورفولوجية وإعادة الترتيب الكامل لعملية التمثيل الغذائي للنبات (من غير متجانس إلى استواء ذاتي)¹. التخليق الحيوي للكلوروفيل هو السمة المميزة لإزالة التلوث الناجم عن الضوء في النباتات وعملية ديناميكية للغاية. يجب تنسيق تكوين الكلوروفيل من السلائف الأولية المنتجة بشكل داكن لتجنب الضرر الناجم عن المنتجات الثانوية التفاعلية². يتم تحفيز اختزال البروتوكلوروفيليد إلى الكلوروفيليد بواسطة مؤكسدات البروتوكلوروفيليد المعتمدة على الضوء (PORs) ، وهي إنزيمات فريدة يتم تنشيطها مباشرة بواسطة الضوء. التفاعل سريع جدا ، يحدث بترتيب ms إلى s

Protocol

1. إعداد المتوسطة

1. تحضير وسط الزراعة عن طريق خلط 0.75 جم من عامل التبلور مع 50 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة زجاجية لتحقيق تركيز 1.5٪ (وزن / حجم) للوحة بتري واحدة (120 × 120 × 17 مم). هز الخليط برفق ثم سخنه في الميكروويف حتى الغليان لإذابة عامل التبلور (يصبح المحلول واضحا).
2. اترك الوسط يبرد إلى 58-60 درجة مئوية قبل المتابعة إلى الخطوات التالية. يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة داخل غطاء التدفق الصفحي لمنع التلوث.
3. استخدم ألواح بتري ذات الحواف الضيقة للضوء لتجنب انعكاس الضوء الأكتيني المفرط والتألق الذاتي العالي للخلفية أثناء القياسات. لهذا ، ضع شريطا لاصقا أسود (أو أي وسيلة أخرى متاحة) لتغطية جميع....

النتائج

يظهر في الشكل 3 الناتج النموذجي الذي تم الحصول عليه باستخدام الإجراء المطور حديثا في شتلات أرابيدوبسيس منزوعة الرتبة من النوع البري (WT) عمرها 4 أيام ، النمط البيئي Columbia-0 (Col-0). في ظل ظروف التحكم (وسائط MS المكملة ب DMSO) ، يبدأ منحنى التخليق الحيوي للكلوروفيل بانفجار أولي لت?.......

Discussion

الخطوات الحاسمة للبروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها - لا يوجد ضوء والعناية بالقناع
كما هو موضح مباشرة في وصف البروتوكول أعلاه ، فإن تجنب حتى الكميات الضئيلة من الضوء سواء أثناء زراعة شتلات النباتات etiolated أو قبل بدء البروتوكول مباشرة له أهمية^{حاسمة 11}. في إعدادنا ، ن.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM