Неинвазивный анализ для определения кинетики биосинтеза хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования арабидопсиса

Резюме

В данной статье мы расскажем о современном инструменте, предназначенном для мониторинга биосинтеза хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования проростков арабидопсиса . Новая методология обеспечивает неинвазивную флуоресцентную визуализацию хлорофилла в режиме реального времени с высоким пространственным и временным разрешением.

Аннотация

Биосинтез хлорофилла является отличительной чертой деэтиолирования, одного из самых драматических этапов жизненного цикла растений. Строго контролируемый и высокодинамичный процесс биосинтеза хлорофилла запускается во время перехода от темноты к свету у цветковых растений. В тот момент, когда этиолированные проростки подвергаются воздействию первых следов солнечного света, быстрое (с точностью до секунд) превращение протохлорофиллида в хлорофиллид опосредовано уникальными светопринимающими белковыми комплексами, приводящими через последующие метаболические этапы к выработке полнофункционального хлорофилла. Стандартные методики анализа содержания хлорофилла включают выделение пигмента из обособленных тканей растений, что не применимо для изучения таких быстрых процессов. Для исследования кинетики хлорофилла in vivo с высокой точностью и пространственно-временным разрешением в первые часы после световой деэтиолляции были разработаны прибор и протокол. Здесь мы представляем подробную процедуру, предназначенную для статистически надежного количественного определения хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования арабидопсиса .

Введение

Деэтиолирование представляет собой наиболее драматичную фазу жизненного цикла растений, характеризующуюся рядом морфологических изменений и полной перестройкой метаболизма растений (от гетеро- до автотропного)¹. Биосинтез хлорофилла является отличительной чертой светоиндуцированной деэтиолляции в растениях и очень динамичным процессом. Образование хлорофилла из темного предшественника протохлорофиллида должно быть тесно скоординировано, чтобы избежать повреждений из-за реакционноспособных побочных продуктов². Восстановление протохлорофиллида до хлорофиллида катализируется светозависимыми протохлорофиллидоксидоредуктазами (ПОР), уникальными ферментами, активируемыми непосредственно светом. Реакция протекает очень быстро, протекая в порядке от мс до^с3, что приводит к заметному накоплению хлорофилла в течение нескольких минут после облучения этиолированных проростков ^4,5,6. Для биогенеза хлоропластов требуется больше времени (от нескольких часов до нескольких дней) для создания полностью функционального фотосинтетического аппарата³.

Существуют различные методы анализа содержания хлорофилла, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) или спектрофотометрию. Обычно эти методы требуют разрушения растительной ткани ^4,5,6, что ограничивает определение изменений уровня хлорофилла с течением времени. Методы, позволяющие установить неинвазивную кинетику хлорофилла, могут открыть совершенно новые перспективы для изучения растений в самых разных аспектах, начиная от фундаментальных научных вопросов, таких как анализ процесса синтеза хлорофилла во времени и пространстве, и заканчивая более практическими приложениями, такими как оценка стрессоустойчивости или влияния биостимуляторов на кинетику хлорофилла. Учитывая это, мы внедрили систему мониторинга образования хлорофилла iReenCAM⁷. Он включает в себя ПЗС-камеру, эмиссионные фильтры, источники света и конвейер для автоматизированного анализа флуоресценции (рис. 1). Главной особенностью разработанного прибора является высокое пространственное и временное разрешение, превосходящее по параметрам, используемым в современных подходах, и достаточная чувствительность и специфичность по сравнению со стандартными аналитическими методами⁷.

Описанная здесь неинвазивная процедура требует минимального количества реагентов и состоит из простых этапов, позволяющих получить профиль кинетики хлорофилла в живых проростках арабидопсиса на самых ранних стадиях деэтиолирования. Протокол может быть полезен для изучения высокодинамичного процесса синтеза хлорофилла под влиянием ряда факторов, как экзогенного (соль, засуха, биостимуляторы, тяжелые металлы и т.д.), так и эндогенного (обычно связанного с изменениями активности генов) по происхождению без необходимости отрыва какой-либо растительной ткани, что позволяет избежать дополнительного стресса.

протокол

1. Подготовка среды

1. Приготовьте питательную среду, смешав 0,75 г желирующего агента с 50 мл стерильной деионизированной воды в стеклянной бутылке для достижения концентрации 1,5% (по массе) для одной чашки Петри (120 x 120 x 17 мм). Аккуратно встряхните смесь, а затем нагрейте ее в микроволновой печи до закипания, чтобы растворился желирующий агент (раствор станет прозрачным).
2. Дайте среде остыть до 58-60 °C, прежде чем переходить к следующим шагам. Все последующие этапы должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном колпаке, чтобы предотвратить загрязнение.
3. Используйте планшеты Петри со светонепроницаемыми краями, чтобы избежать чрезмерного отражения актинического света и высокой фоновой автофлуоресценции во время измерений. Для этого наклейте черную клейкую ленту (или другое доступное средство), чтобы покрыть все стороны пустой чашки Петри (рисунок 2).
4. После наложения ленты провести стерилизацию пластины (пластин) путем облучения бактерицидной УФ-лампой в течение 20-30 минут.
5. Если эксперимент включает в себя химическую обработку (например, абиотические/биотические стрессоры, растительные гормоны и/или регуляторы роста и т. д.), добавьте соответствующее количество соответствующего химического вещества непосредственно в среду. Имейте в виду, что в среду добавляется выбранная химическая стабильность (например, если химическое вещество не термостабильно, добавьте в среду, когда она остынет, непосредственно перед заливкой в пластину). Тщательно перемешайте среду, встряхивая, чтобы обеспечить равномерное распределение химиката.
6. Избегайте подсветки пластин ультрафиолетовым светом после заливки среды (это может привести к образованию кислородных радикалов, которые могут помешать эксперименту).
7. Вылейте подготовленную среду в квадратную чашку (планшеты) Петри и дайте среде затвердеть при комнатной температуре.

2. Стерилизация поверхности семян и условия роста растений

1. Необходимое количество семян Arabidopsis thaliana Col-0 достать из заготовки (10-20 мг) и добавить в пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Никаких специфических модификаций при работе с различными линиями Arabidopsis (линии экотипа/мутантов) не требуется. Для других видов растений ревизию решетки и измерений следует проводить с учетом разницы в размерах семян, всхожести и размерах проростков.
2. Стерилизуйте семена арабидопсиса с поверхности, добавив в пробирку 70% этанола в течение 2 минут. Аккуратно встряхните пробирки во время стерилизации.
3. Осторожно удалите этанол с помощью пипетки, стараясь не потерять семена. Промойте семена, добавив стерильную воду в пробирку на 5 минут, чтобы удалить остатки этанола (осторожно встряхните пробирки во время промывки).
4. Дайте семенам оседать на дно пробирки под действием силы тяжести, удалите оставшуюся воду.
5. Еще раз промойте семена 2 раза стерильной водой, как описано в шаге 2.3, чтобы убедиться, что в них нет никаких признаков этанола. Дайте семенам оседать на дно пробирки под действием силы тяжести, удалите оставшуюся воду.
6. Добавьте равный объем стерильной воды в пробирку с семенами, чтобы создать суспензию из семян и воды.
7. Используйте посевную сетку, чтобы равномерно распределить семенно-водную суспензию данного генотипа на выбранных участках средней пластины (рис. 2 и дополнительный рис. 1). Распределите семена (примерно 30-40) в ряд на каждом участке с помощью широкого наконечника пипетки.
8. Дайте воде высохнуть в семенных зонах в течение примерно 30 минут, держа пластину (тарелки) открытой в ламинарном колпаке, чтобы предотвратить загрязнение. Заклейте пластину лентой с микропорами и оберните алюминиевой фольгой.
9. Стратифицируйте семена в течение 3 дней при температуре 4 °C в темноте, чтобы (в зависимости от используемого экотипа) преодолеть период покоя семян и/или способствовать равномерному прорастанию.
10. Переложите планшет со стратифицированными семенами на белый свет (150 мкмоль/^м2/с) на 1 ч, чтобы вызвать прорастание (разверните фольгу только для световой обработки).
11. После световой обработки оберните тарелку алюминиевой фольгой, чтобы защитить семена от света, поместите в вертикальное положение в камеру роста и культивируйте в течение 4 дней в темноте при температуре 21 °C.

3. Измерение и анализ флуоресценции хлорофилла

1. Включите систему iReenCAM и убедитесь, что система готова и правильно настроена в автоматически запускаемом серверном программном обеспечении PS (например, достаточно ли места для хранения данных эксперимента, подключена ли флуоресцентная камера к ПК и т. д.).
2. Активируйте программное обеспечение планировщика, чтобы создать план эксперимента для измерения, щелкнув Эксперименты > Новый эксперимент. Укажите описательное название эксперимента и заполните сведения (описание).
3. Задайте необходимые действия для эксперимента, нажав кнопку Добавить действие , что приведет к расписанию экспериментальных действий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слово «действие» здесь означает выполнение полного эксперимента (т.е. включая все шаги, необходимые для выполнения одного измерения планшета).
4. Укажите условия для одного круглого измерения (т.е. продолжительность периода света/темноты).
5. Нажав кнопку Generate List, задайте временные интервалы между измерениями раундов. Выберите время начала и окончания раунда (всего 4 часа) и интервалы между раундами (в текущей конфигурации один раунд каждые 2 минуты).
6. Нажмите «Создать» и убедитесь, что временные рамки и интервалы между световыми импульсами верны, проверив список, сгенерированный в левой части экрана.
7. Выберите протокол измерения (Дополнительный рисунок 2). Сохраните все изменения в базе данных для использования в будущем.
8. Непосредственно перед началом измерения используйте зеленый свет низкой интенсивности (см. Таблицу материалов) в темной комнате и отрегулируйте уровень полки внутри измерительной камеры или выполните другие подготовительные действия, прежде чем снимать фольгу с планшета Петри. Затем выключите свет и перенесите пластины в измерительную камеру в полной темноте.
9. Осторожно снимите алюминиевую фольгу, закрывающую планшет Петри, содержащую 4-дневные саженцы. Поместите планшет Петри горизонтально внутрь измерительной камеры прибора. Внутри камеры индуцируют актинические световые импульсы и выполняют визуализацию в соответствии с планом эксперимента (действиями), заданным в шагах 3.1-3.7.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать любого освещения пластин с этиолированными проростками перед помещением их в измерительную камеру. Манипуляции с пластиной с этиолированными проростками необходимо проводить в темном помещении/камере (возможную экспериментальную установку см. на дополнительном рисунке 3).

4. Извлечение и анализ данных

1. После завершения измерения откройте соответствующий эксперимент в программном обеспечении анализатора.
2. Чтобы проанализировать флуоресценцию проростков, сгенерируйте два типа масок: грубую (лотковую) маску, которая покрывает область, где расположены проростки, и точную (растительную) маску, которая покрывает только интересующую ткань (обычно семядоли).
3. Создайте маску лотка, щелкнув опцию Create New Tray Type . Присвойте соответствующие названия генотипов соответствующим областям на изображении пластины.
4. Для присвоения генотипа выберите номер изображения в Раунде , а затем нажмите Загрузить изображение в верхней части экрана. Изображение таблички отобразится на экране. Нажав на любую из множества кнопок, представляющих различные инструменты рисования фигур (Дополнительный рисунок 4), войдите в New Shape Mode , который позволяет нарисовать интересующую область на изображении пластины. Выберите необходимые области (например, различные генотипы на табличке) и дайте им соответствующие названия.
5. Нажмите клавишу Esc, чтобы выйти из режима фигуры. Сохраните сгенерированную маску лотка (предварительно указав для нее имя), нажав кнопку Сохранить тип лотка.
6. Вернитесь на шаг назад и примените маску, созданную на предыдущих шагах, выбрав ее имя в параметре «Изменить по типу лотка ».
7. Чтобы создать маску растения с высокой точностью, используйте изображение, полученное после 180 минут измерения (раунд 91), чтобы установить минимальное пороговое значение интенсивности сигнала флуоресценции, позволяющее вычитание фонового шума. Для этого снимите галочку с Auto Threshold и установите Manual Threshold на 0 (Дополнительный рисунок 4).
8. Нажмите кнопку Предварительный просмотр, чтобы убедиться, что маска лотка покрывает все необходимые области (генотипы) на изображении пластины. Для этого выберите раунд 91 и нажмите Обновить предварительный просмотр.
9. Войдите в меню «Выполнить», нажав кнопку «Выполнить». Запустите анализ исключительно для 91-го раунда, поставив галочку только на 91-м раунде. Затем выберите выходной путь и нажмите кнопку Начать анализ.
10. После завершения анализа автоматически откроется меню Готово. Выберите выполненный раунд (он будет единственным) из экспериментов и нажмите Переключить анализатор на Анализируемые данные , чтобы экспортировать данные для этого конкретного момента времени (раунд 91).
11. Извлеките файл .xsel из экспортированного архива, так как этот файл содержит важную информацию о маске растения, нажав на значок Open Export Part .
12. Снова откройте эксперимент, щелкнув значок Open Local Analysis Part . Снова войдите в меню Mask Builder , нажмите Load Image, выберите раунд 1, а затем Load from File в правом верхнем углу экрана и загрузите ранее извлеченный файл .xsel. Изображение пластины будет показано с примененной маской лотка.
13. Сохраните маску, нажав кнопку Store Tray Type , и примените ее, выбрав ее имя в опции Change by Tray Type .
14. Сгенерируйте маску растения, настроив порог интенсивности сигнала флуоресценции. Увеличивайте значение Ручного порога до тех пор, пока маска, сгенерированная в меню Просмотра , не будет идеально соответствовать ROI (например, семядолям) в каждом из генотипов (Дополнительный рисунок 4). Проверьте, подходит ли маска ко всем раундам измерений, прокручивая раунды (проверки правильного положения маски на раундах 1, 61 и 121 должно быть достаточно) в меню предварительного просмотра .
15. Выполните анализ для всех измерительных циклов и экспортируйте данные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходной файл включает значения флуоресценции хлорофилла данного генотипа для каждого момента времени, что позволяет строить диаграммы выбора и облегчает дальнейшую статистическую оценку.

Результаты

Типичный результат, полученный по вновь разработанной методике на 4-дневных деэтиолированных сеянцах арабидопсиса дикого типа (WT), экотипа Колумбия-0 (Col-0), показан на рисунке 3. В контрольных условиях (среда МС с добавлением ДМСО) кривая биосинтеза хлорофилла начинае...

Обсуждение

Критические шаги протокола и устранение неполадок - нет света и берегите маску
Как подчеркивается непосредственно в приведенном выше описании протокола, критически важное значение имеет избегание даже следовых количеств света как во время культивирования этиолированных р...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM