Неинвазивный анализ для определения кинетики биосинтеза хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования арабидопсиса

Резюме

В данной статье мы расскажем о современном инструменте, предназначенном для мониторинга биосинтеза хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования проростков арабидопсиса . Новая методология обеспечивает неинвазивную флуоресцентную визуализацию хлорофилла в режиме реального времени с высоким пространственным и временным разрешением.

Аннотация

Биосинтез хлорофилла является отличительной чертой деэтиолирования, одного из самых драматических этапов жизненного цикла растений. Строго контролируемый и высокодинамичный процесс биосинтеза хлорофилла запускается во время перехода от темноты к свету у цветковых растений. В тот момент, когда этиолированные проростки подвергаются воздействию первых следов солнечного света, быстрое (с точностью до секунд) превращение протохлорофиллида в хлорофиллид опосредовано уникальными светопринимающими белковыми комплексами, приводящими через последующие метаболические этапы к выработке полнофункционального хлорофилла. Стандартные методики анализа содержания хлорофилла включают выделение пигмента из обособленных тканей растений, что не применимо для изучения таких быстрых процессов. Для исследования кинетики хлорофилла in vivo с высокой точностью и пространственно-временным разрешением в первые часы после световой деэтиолляции были разработаны прибор и протокол. Здесь мы представляем подробную процедуру, предназначенную для статистически надежного количественного определения хлорофилла на ранних стадиях деэтиолирования арабидопсиса .

Введение

Деэтиолирование представляет собой наиболее драматичную фазу жизненного цикла растений, характеризующуюся рядом морфологических изменений и полной перестройкой метаболизма растений (от гетеро- до автотропного)¹. Биосинтез хлорофилла является отличительной чертой светоиндуцированной деэтиолляции в растениях и очень динамичным процессом. Образование хлорофилла из темного предшественника протохлорофиллида должно быть тесно скоординировано, чтобы избежать повреждений из-за реакционноспособных побочных продуктов². Восстановление протохлорофиллида до хлорофиллида катализируется светозависимыми протохлорофиллидоксидоредуктазами....

протокол

1. Подготовка среды

1. Приготовьте питательную среду, смешав 0,75 г желирующего агента с 50 мл стерильной деионизированной воды в стеклянной бутылке для достижения концентрации 1,5% (по массе) для одной чашки Петри (120 x 120 x 17 мм). Аккуратно встряхните смесь, а затем нагрейте ее в микроволновой печи до закипания, чтобы растворился желирующий агент (раствор станет прозрачным).
2. Дайте среде остыть до 58-60 °C, прежде чем переходить к следующим шагам. Все последующие этапы должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном колпаке, чтобы предотвратить загрязнение.
3. Используйте планшеты Петри со светонепроницаемыми краями, ....

Результаты

Типичный результат, полученный по вновь разработанной методике на 4-дневных деэтиолированных сеянцах арабидопсиса дикого типа (WT), экотипа Колумбия-0 (Col-0), показан на рисунке 3. В контрольных условиях (среда МС с добавлением ДМСО) кривая биосинтеза хлорофилла начинае.......

Обсуждение

Критические шаги протокола и устранение неполадок - нет света и берегите маску
Как подчеркивается непосредственно в приведенном выше описании протокола, критически важное значение имеет избегание даже следовых количеств света как во время культивирования этиолированных р.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM