Ensayo no invasivo para la determinación cinética de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de Arabidopsis

Resumen

Aquí, describimos una herramienta avanzada diseñada para el monitoreo de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de plántulas de Arabidopsis . La novedosa metodología proporciona imágenes no invasivas de fluorescencia de clorofila en tiempo real a alta resolución espacial y temporal.

Resumen

La biosíntesis de clorofila es un sello distintivo de la desetiolación, una de las etapas más dramáticas en el ciclo de vida de las plantas. El proceso de biosíntesis de clorofila, estrechamente controlado y altamente dinámico, se desencadena durante el cambio de la oscuridad a la luz en las plantas con flores. En el momento en que las plántulas etioladas se exponen a los primeros rastros de luz solar, la conversión rápida (en orden de segundos) de protoclorofilida en clorofilia está mediada por complejos proteicos únicos que aceptan la luz, lo que conduce a través de pasos metabólicos posteriores a la producción de clorofila completamente funcional. Las técnicas estándar para el análisis del contenido de clorofila incluyen la extracción de pigmentos de tejidos vegetales desprendidos, lo que no se aplica al estudio de procesos tan rápidos. Para investigar la cinética de la clorofila in vivo con alta precisión y resolución espacio-temporal en las primeras horas después de la desetiolación inducida por la luz, se desarrollaron un instrumento y un protocolo. Aquí, presentamos un procedimiento detallado diseñado para la cuantificación estadísticamente robusta de clorofila en las primeras etapas de la desetiolación de Arabidopsis .

Introducción

La desetiolación representa la fase más dramática del ciclo de vida de las plantas, caracterizada por una serie de cambios morfológicos y un reordenamiento completo del metabolismo de las plantas (de hetero a autotrópico)¹. La biosíntesis de clorofila es un sello distintivo de la desetiolación inducida por la luz en las plantas y un proceso muy dinámico. La formación de clorofila a partir de protoclorofilida, precursora producida en la oscuridad, debe coordinarse estrechamente para evitar daños debidos a subproductos reactivos². La reducción de protoclorofílidos a clorofilida es catalizada por protoclorofilidos oxidorreductasas dependientes de la luz (POR), enzimas únicas activadas directamente por la luz. La reacción es muy rápida, teniendo lugar en el orden de ms a s³, lo que lleva a una acumulación de clorofila reconocible en cuestión de minutos después de la irradiación etiolada de las plántulas ^4,5,6. Se requiere más tiempo (de horas a días) para que la biogénesis del cloroplasto establezca un aparato fotosintético completamente funcional³.

Existen varios métodos para analizar el contenido de clorofila, incluida la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o la espectrofotometría. Por lo general, estas técnicas exigen la destrucción del tejido vegetal ^4,5,6, lo que restringe la determinación de los cambios en los niveles de clorofila a lo largo del tiempo. Los métodos que permiten el establecimiento de la cinética de clorofila no invasiva pueden abrir una perspectiva completamente nueva para estudiar las plantas en diversos aspectos que van desde preguntas de investigación fundamentales, como el análisis del proceso de síntesis de clorofila en el tiempo y el espacio, hasta aplicaciones más prácticas, como la evaluación de la tolerancia al estrés o el efecto de los bioestimulantes en la cinética de la clorofila. Teniendo esto en cuenta, introdujimos un sistema para monitorear la formación de clorofila, iReenCAM⁷. Incorpora una cámara CCD, filtros de emisión, fuentes de luz y una tubería para el análisis automatizado de fluorescencia (Figura 1). La característica principal del dispositivo desarrollado es la alta resolución espacial y temporal, que supera los parámetros utilizados en los enfoques actuales, y la sensibilidad y especificidad suficientes en comparación con los métodos analíticos estándar⁷.

El procedimiento no invasivo aquí descrito requiere un mínimo de reactivos y comprende pasos simples, lo que permite obtener un perfil cinético de clorofila en plántulas vivas de Arabidopsis durante etapas muy tempranas de desetiolación. El protocolo puede ser útil para el estudio de procesos altamente dinámicos de síntesis de clorofila influenciados por una serie de factores, tanto exógenos (sal, sequía, bioestimulantes, metales pesados, etc.) como endógenos (típicamente asociados a cambios en la actividad génica) de origen sin necesidad de desprender ningún tejido vegetal, evitando así estrés adicional.

Protocolo

1. Preparación media

1. Prepare el medio de cultivo mezclando 0,75 g de gelificante con 50 ml de agua desionizada estéril en una botella de vidrio para lograr una concentración del 1,5% (p/v) para una placa de Petri (120 x 120 x 17 mm). Agite suavemente la mezcla y luego caliéntela en un microondas hasta que hierva para disolver el agente gelificante (la solución se vuelve clara).
2. Deje que el medio se enfríe a 58-60 °C antes de continuar con los siguientes pasos. Todos los pasos posteriores deben realizarse en condiciones estériles dentro de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
3. Utilice placas de Petri con bordes herméticos a la luz para evitar una reflexión excesiva de la luz actínica y una alta autofluorescencia de fondo durante las mediciones. Para ello, aplique cinta adhesiva negra (u otros medios disponibles) para cubrir todos los lados de la placa de Petri vacía (Figura 2).
4. Realice la esterilización de la(s) placa(s) después de la aplicación de la cinta mediante irradiación con lámpara UV germicida durante 20-30 min.
5. Si el experimento implica un tratamiento químico (es decir, estresores abióticos/bióticos, hormonas vegetales y/o reguladores del crecimiento, etc.), agregue la cantidad apropiada del producto químico correspondiente directamente al medio. Tenga en cuenta que se agrega una estabilidad química elegida al medio (por ejemplo, si el producto químico no es termoestable, agréguelo al medio cuando se enfríe justo antes de verterlo en la placa). Mezcle bien el medio agitándolo para asegurar una distribución uniforme del producto químico.
6. Evite la iluminación de las placas a la luz ultravioleta después de verter el medio (conduciría a la producción de radicales de oxígeno que podrían interferir con el experimento).
7. Vierta el medio preparado en la(s) placa(s) de Petri cuadrada y deje que el medio se solidifique a temperatura ambiente.

2. Esterilización de la superficie de la semilla y condiciones de crecimiento de las plantas

1. Obtenga la cantidad requerida de semillas de Arabidopsis thaliana Col-0 del balk original (10-20 mg) y agréguela a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
   NOTA: No es necesario realizar modificaciones específicas al trabajar con diferentes líneas de Arabidopsis (ecotipo/líneas mutantes). La revisión de la rejilla de aserrado y los pasos de medición deben realizarse para otras especies de plantas teniendo en cuenta la diferencia en el tamaño de la semilla, la tasa de germinación y el tamaño de la plántula.
2. Esterilizar las semillas de Arabidopsis añadiendo etanol al 70% al tubo durante 2 min. Agite suavemente los tubos durante la esterilización.
3. Retire el etanol pipeteando con cuidado, teniendo cuidado de no perder semillas. Lave las semillas agregando agua estéril al tubo durante 5 minutos para eliminar cualquier residuo de etanol (agite suavemente los tubos durante el período de lavado).
4. Deje que las semillas se sedimenten en el fondo del tubo por gravedad, elimine el agua restante.
5. Enjuague las semillas nuevamente 2 veces con agua estéril como se describe en el paso 2.3 para asegurarse de que estén libres de cualquier rasgo de etanol. Deje que las semillas se sedimenten en el fondo del tubo por gravedad, elimine el agua restante.
6. Agregue un volumen igual de agua estéril al tubo que contiene las semillas para crear una suspensión de agua y semillas.
7. Utilice una rejilla de siembra para distribuir uniformemente la suspensión de agua de semilla del genotipo dado en las áreas seleccionadas de la placa del medio (Figura 2 y Figura 1 suplementaria). Distribuya las semillas (aproximadamente 30-40) en una fila en cada área usando una punta de pipeta ancha.
8. Deje que el agua se seque en las áreas de semillas durante unos 30 minutos, manteniendo la(s) placa(s) abierta(s) en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Selle la placa con cinta adhesiva de microporos y envuélvala con papel de aluminio.
9. Estratificar las semillas durante 3 días a 4 °C en oscuridad para (dependiendo del ecotipo utilizado) superar la latencia de la semilla y/o promover una germinación uniforme.
10. Transfiera la placa con semillas estratificadas a luz blanca (150 μmol/m²/s) durante 1 h para inducir la germinación (desenvuelva la lámina solo para el tratamiento de luz).
11. Después del tratamiento con luz, envuelva la placa con papel de aluminio para proteger las semillas de la luz y colóquela en posición vertical en una cámara de crecimiento y cultive durante 4 días en la oscuridad a 21 °C.

3. Medición y análisis de fluorescencia de clorofila

1. Encienda el sistema iReenCAM y asegúrese de que el sistema esté listo y configurado correctamente en el software del servidor PS iniciado automáticamente (por ejemplo, si hay suficiente espacio de almacenamiento para los datos del experimento, si la cámara de fluorescencia está conectada a la PC, etc.).
2. Active el software Programador para crear el plan experimental para la medición haciendo clic en Experimentos > Nuevo experimento. Proporcione un nombre descriptivo para el experimento y rellene los detalles (descripción).
3. Establezca las acciones necesarias para el experimento haciendo clic en Agregar acción , lo que conducirá a la programación de acciones experimentales.
   NOTA: La palabra acción aquí significa realizar un experimento completo (es decir, incluir todos los pasos necesarios para realizar una medición de placa).
4. Especifique las condiciones para una sola medición redonda (es decir, la duración del período de luz/oscuridad).
5. Al hacer clic en Generar lista , defina los intervalos de tiempo entre rondas de medición. Elija la hora en la que comenzará y terminará la ronda (4 h en total) y los intervalos entre las rondas (en la configuración actual, una ronda cada 2 minutos).
6. Haga clic en Generar y asegúrese de que el marco de tiempo y los intervalos entre los impulsos de luz sean correctos comprobando la lista generada en el lado izquierdo de la pantalla.
7. Elija el protocolo de medición (Figura complementaria 2). Guarde todas las modificaciones en la base de datos para futuras consultas.
8. Justo antes de que comience la medición, use luz verde de baja intensidad (consulte la Tabla de materiales) dentro de la sala oscura y ajuste el nivel del estante dentro de la cámara de medición o realice otros pasos de preparación antes de retirar la lámina de la placa de Petri. A continuación, apague la luz y transfiera las placas a la cámara de medición en completa oscuridad.
9. Retire con cuidado el papel de aluminio que cubre la placa de Petri que contiene las plántulas de 4 días. Coloque la placa de Petri horizontalmente dentro de la cámara de medición del dispositivo. Dentro de la cámara, induzca pulsos de luz actínica y realice imágenes de acuerdo con el plan del experimento (acciones) establecido en los pasos 3.1-3.7.
   NOTA: Es fundamental evitar cualquier iluminación de las placas con plántulas etioladas antes de colocarlas en la cámara de medición. La manipulación con la placa con plántulas etioladas debe realizarse en el cuarto oscuro/cámara (para una posible configuración experimental, consulte la Figura complementaria 3).

4. Extracción y análisis de datos

1. Después de completar la medición, abra el experimento correspondiente en el software del analizador.
2. Para analizar la fluorescencia de las plántulas, genere dos tipos de máscaras: una máscara rugosa (bandeja) que cubra el área donde se encuentran las plántulas y una máscara precisa (planta) que cubra solo el tejido de interés (generalmente cotiledones).
3. Genere una máscara de bandeja haciendo clic en la opción Crear nuevo tipo de bandeja . Asigne los nombres de genotipo apropiados a las áreas respectivas en la imagen de la placa.
4. Para asignar el genotipo, elija un número de imagen en Redondo y luego haga clic en Cargar imagen en la parte superior de la pantalla. La imagen de la placa se mostrará en la pantalla. Al hacer clic en cualquiera de los conjuntos de botones que representan diferentes herramientas de dibujo de formas (Figura complementaria 4), ingrese al modo Nueva forma que permite dibujar el área de interés en la imagen de la placa. Elija las áreas necesarias (por ejemplo, diferentes genotipos en la placa) y proporcione su nombre apropiado.
5. Haga clic en Esc para salir del modo de forma. Guarde la máscara de bandeja generada (después de proporcionarle un nombre) haciendo clic en Tipo de bandeja de almacenamiento.
6. Retroceda un paso y aplique la máscara que se generó en los pasos anteriores seleccionando su nombre en la opción Cambiar por tipo de bandeja .
7. Para generar una máscara vegetal con alta precisión, utilice la imagen adquirida después de 180 minutos de medición (ronda 91) para establecer el valor umbral mínimo para la intensidad de la señal de fluorescencia, lo que permite la sustracción del ruido de fondo. Para ello, quite la marca de verificación del umbral automático y establezca un umbral manual en 0 (Figura complementaria 4).
8. Haga clic en Vista previa para asegurarse de que la máscara de bandeja cubra todas las áreas necesarias (genotipos) en la imagen de la placa. Para ello, elija la ronda 91 y haga clic en Actualizar vista previa.
9. Para entrar en el menú Ejecutar, haga clic en Ejecutar. Ejecute el análisis exclusivamente para la ronda 91 colocando una marca solo en la ronda 91. A continuación, elija la ruta de salida y haga clic en Iniciar análisis.
10. Una vez finalizado el análisis, el menú Finalizar se abrirá automáticamente. Elija la ronda ejecutada (será la única) de los experimentos y haga clic en Cambiar analizador a datos analizados para exportar los datos de este punto de tiempo específico (ronda 91).
11. Extraiga el archivo .xsel del archivo exportado, ya que este archivo contiene la información esencial de la máscara de planta haciendo clic en el icono Abrir pieza de exportación .
12. Vuelva a abrir el experimento haciendo clic en el icono Abrir parte de análisis local . Ingrese al menú Mask Builder nuevamente, haga clic en Cargar imagen, elija la ronda 1 y luego Cargar desde archivo en la esquina superior derecha de la pantalla y cargue el archivo .xsel extraído anteriormente. La imagen de la placa se mostrará con la máscara de bandeja aplicada.
13. Guarde la máscara haciendo clic en Almacenar tipo de bandeja y aplíquela seleccionando su nombre en la opción Cambiar por tipo de bandeja .
14. Genere la máscara vegetal ajustando el umbral de intensidad de la señal de fluorescencia. Aumente el valor de Umbral manual hasta que la máscara generada en el menú Vista previa se ajuste perfectamente al ROI (por ejemplo, cotiledones) en cada uno de los genotipos (Figura complementaria 4). Compruebe si la máscara se ajusta a todas las rondas de las medidas desplazándose a lo largo de las rondas (verificar la posición correcta de la máscara en la ronda 1, 61 y 121 debería ser suficiente) en el menú Vista previa .
15. Realice el análisis de todas las rondas de medición y exporte los datos.
    NOTA: El archivo de salida incluye los valores de fluorescencia de clorofila de un genotipo dado para cada punto de tiempo, lo que permite la construcción de gráficos de elección y facilita una evaluación estadística adicional.

Resultados

En la Figura 3 se muestra el resultado típico obtenido utilizando el procedimiento recientemente desarrollado en las plántulas de Arabidopsis desetioladas de 4 días de edad del ecotipo silvestre (WT) Columbia-0 (Col-0). En condiciones de control (medios MS suplementados con DMSO), la curva biosintética de clorofila comienza con un estallido inicial de la síntesis de clorofila, en el que el pool de protoclorfílidos sintetizado durante la fase escotomorfogénica del crecimiento,...

Discusión

Pasos críticos del protocolo y solución de problemas: no hay luz y se cuida la mascarilla
Como se destaca directamente en la descripción del protocolo anterior, es de vital importancia evitar incluso las pequeñas cantidades de luz tanto durante el cultivo de plántulas de plantas etioladas como justo antes de comenzar el protocolo¹¹. En nuestra configuración, utilizamos una cámara oscura dedicada ubicada en el fitotrón de entrada y separada del resto del fitotrón con un...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM