シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

要約

ここでは、 シロイヌナズ ナの苗木の脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成モニタリング用に設計された高度なツールについて説明します。この新しい方法論は、高い空間分解能と時間分解能で非侵襲的なリアルタイムクロロフィル蛍光イメージングを提供します。

要約

クロロフィルの生合成は、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階の1つである脱エチオール化の特徴です。クロロフィル生合成の厳密に制御された非常にダイナミックなプロセスは、顕花植物の暗闇から光への移行中に引き起こされます。エチオレートされた苗木が日光の最初の痕跡にさらされた瞬間に、プロトクロロフィリドからクロロフィリドへの急速な(秒順の)変換は、ユニークな光受容タンパク質複合体によって媒介され、その後の代謝ステップを介して完全に機能するクロロフィルの生産につながります。クロロフィル含有量分析の標準的な手法には、剥離した植物組織からの色素抽出が含まれますが、このような高速プロセスの研究には適用されません。光誘起脱エチオレーション後の最初の数時間で、 生体内の クロロフィル動態を高精度かつ時空間分解能で調査するために、装置とプロトコルが開発されました。ここでは、 シロイヌナズ ナの脱エチオレーションの初期段階におけるクロロフィルの統計的に頑健な定量のために設計された詳細な手順を紹介します。

概要

脱エチオレーションは、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階であり、多くの形態学的変化と植物代謝の完全な再編成(ヘテロから自己熱帯へ)を特徴としています¹。クロロフィルの生合成は、植物における光による脱エチオール化の特徴であり、非常にダイナミックなプロセスです。暗色で産生された前駆体プロトクロロフィリドからのクロロフィルの形成は、反応性副生成物による損傷を避けるために緊密に調整する必要があります²。プロトクロロフィリドのクロロフィリドへの還元は、光によって直接活性化されるユニークな酵素である光依存性プロトクロロフィリド酸化還元酵素(POR)によって触媒されます。反応は非常に速く、msから^{s 3}のオーダーで起こり、苗^の照射後数分以内に認識可能なクロロフィルの蓄積をもたらす^4,5,6。葉緑体生合成が完全に機能する光合成装置^{を確立する}には、より多くの時間(数時間から数日)が必要である3。

クロロフィル含有量の分析には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や分光光度法など、さまざまな方法があります。通常、これらの技術は植物組織の破壊を要求し^4,5,6、時間の経過に伴うクロロフィルレベルの変化の決定を制限します。非侵襲的なクロロフィル動態の確立を可能にする方法は、時間と空間におけるクロロフィル合成プロセスの解析などの基礎的な研究課題から、ストレス耐性の評価やクロロフィル動態に対するバイオスティミュラントの効果などのより実用的な応用に至るまで、さまざまな側面で植物を研究するためのまったく新しい視点を開く可能性があります。そこで、クロロフィル形成をモニタリングするシステム「iReenCAM⁷」を導入しました。CCDカメラ、発光フィルター、光源、自動蛍光分析用パイプラインを内蔵しています(図1)。開発した装置の主な特徴は、空間分解能と時間分解能が高く、現在のアプローチで使用されているパラメータを上回り、標準的な分析方法と比較して十分な感度と特異性を備えていることです⁷。

ここで説明する非侵襲的手順は、最小限の試薬を必要とし、簡単な手順で構成されているため、脱エチオレーションの非常に初期の段階で生きている シロイヌナズナ の苗木のクロロフィル動態プロファイルを得ることができます。従ってプロトコルは要因の数によって、外因性(塩、干ばつ、biostimulants、重金属、等)および内生(普通遺伝子の活動の変更と関連付けられる)によって影響されるクロロフィル統合の非常にダイナミックなプロセスの調査のために有用である場合もある従って付加的な圧力を避ける植物ティッシュを取り外しないで起源で。

プロトコル

1. 培地の調製

1. ガラス瓶にゲル化剤0.75gと滅菌脱イオン水50mLを混合し、ペトリプレート1枚(120×120×17mm)に対して1.5%(w/v)の濃度となるように培養培地を調製する。混合物を静かに振ってから、沸騰するまで電子レンジで加熱してゲル化剤を溶かします(溶液が透明になります)。
2. 次のステップに進む前に、培地を58〜60°Cまで冷ましてください。その後のすべてのステップは、汚染を防ぐために、層流フード内の無菌条件下で実行する必要があります。
3. 測定中の過度の活性光反射や高いバックグラウンド自家蛍光を避けるために、遮光性エッジを備えたペトリプレートを使用してください。このためには、黒い粘着テープ(または利用可能な他の手段)を貼り付けて、空のペトリプレートのすべての側面を覆います(図2)。
4. テープ貼付後、殺菌剤UVランプを20〜30分間照射してプレートの滅菌を行います。
5. 実験に化学的処理(すなわち、非生物的/生物的ストレッサー、植物ホルモンおよび/または成長調節剤など)が含まれる場合は、対応する化学物質を適切な量で培地に直接添加します。選択した化学的安定性が培地に添加されることに注意してください(たとえば、化学物質が熱安定性でない場合は、プレートに注ぐ直前に培地が冷却されたときに培地に添加します)。薬品が均一に分布するように、振とうして培地を完全に混合します。
6. 培地を注いだ後、プレートをUV光で照らすことは避けてください(実験に支障をきたす可能性のある酸素ラジカルの生成につながります)。
7. 調製した培地を正方形のペトリプレートに注ぎ、培地を室温で固化させます。

2.種子表面の殺菌と植物の生育条件

1. ストックバーク(10〜20 mg)からシ ロイヌナズナ Col-0種子を必要量取り、2 mLの微量遠心チューブに加えます。
   注:異なる シロイヌナズ ナ系統(エコタイプ/変異系統)で作業する場合、特別な変更は必要ありません。鋸引きグリッドの改訂と測定手順は、種子サイズ、発芽率、および苗サイズの違いを考慮して、他の植物種に対して実行する必要があります。
2. シロイヌナズナの種子をチューブに70%エタノールを2分間添加して表面殺菌します。滅菌中はチューブを静かに振ってください。
3. 種子を失わないように注意しながら、ピペッティングでエタノールを除去します。チューブに滅菌水を5分間加えて種子を洗浄し、残留エタノールを取り除きます(洗浄期間中はチューブを静かに振ってください)。
4. 種子を重力によってチューブの底に沈殿させ、残りの水を取り除きます。
5. ステップ2.3の説明に従って、種子を滅菌水で2回再度すすぎ、エタノール特性がないことを確認します。種子を重力によってチューブの底に沈殿させ、残りの水を取り除きます。
6. 種子の入ったチューブに等量の滅菌水を加えて、種子水懸濁液を作成します。
7. 播種グリッドを使用して、培地プレートの選択された領域に特定の遺伝子型の種子水懸濁液を均等に分配します(図2 および 補足図1)。幅広のピペットチップを使用して、各領域に種子(約30〜40個)を一列に分配します。
8. 種子エリアで水を約30分間乾燥させ、汚染を防ぐために層流フードでプレートを開いたままにします。プレートをマイクロポアテープで密封し、アルミホイルで包みます。
9. 種子を暗闇で4°Cで3日間層別化し、(使用する生態型に応じて)種子の休眠を克服したり、均一な発芽を促進したりします。
10. 成層種子の入ったプレートを白色光(150 μmol/m²/s)に1時間移し、発芽を誘導します(光処理の場合にのみホイルを開封します)。
11. 光処理後、種子を光から保護するためにプレートをアルミホイルで包み、育成室に垂直に置き、21°Cの暗所で4日間栽培します。

3. クロロフィル蛍光測定・分析

1. iReenCAMシステムの電源を入れ、自動的に起動するPSサーバーソフトウェアでシステムの準備が整っており、正しく設定されていることを確認します(例:実験データに十分なストレージスペースがあるかどうか、蛍光カメラがPCに接続されている場合など)。
2. スケジューラーソフトウェアをアクティブにし、 実験>新しい実験をクリックして、測定の実験計画を作成します。実験のわかりやすい名前を入力し、詳細 (説明) を入力します。
3. [ アクションの追加 ] をクリックして、実験に必要なアクションを設定し、実験アクションのスケジュールを表示します。
   注:ここでのアクションという言葉は、完全な実験(つまり、1つのプレート測定を実行するために必要なすべてのステップを含む)を実行することを意味します。
4. 1回のラウンド測定の条件(明暗期間の長さ)を指定します。
5. 「リストを生成」(Generate List) をクリックして、測定ラウンドの間隔を定義します。ラウンドの開始時刻と終了時刻(合計4時間)とラウンド間の間隔(現在の設定では2分に1ラウンド)を選択します。
6. [ 生成 ]をクリックし、画面の左側に生成されたリストをチェックして、時間枠と光インパルスの間隔が正しいことを確認します。
7. 測定プロトコルを選択します(補足図2)。後で参照できるように、すべての変更をデータベースに保存します。
8. 測定開始直前に、暗室内で低強度の緑色の光( 材料表を参照)を使用し、測定チャンバー内の棚のレベルを調整するか、その他の準備手順を実行してから、ペトリプレートからホイルを取り外します。次に、ライトをオフにし、完全な暗闇の中でプレートを測定チャンバーに移します。
9. 生後4日の苗が入ったペトリプレートを覆っているアルミホイルを慎重に取り除きます。ペトリプレートをデバイス測定チャンバー内に水平に置きます。チャンバー内では、活性光パルスを誘導し、ステップ3.1〜3.7で設定した実験計画(アクション)に従ってイメージングを行います。
   注:プレートを測定チャンバーに入れる前に、エチオレートされた苗木でプレートを照らさないようにすることが重要です。エチオレートされた苗木を含むプレートによる操作は、暗室/チャンバーで実行する必要があります(可能な実験セットアップについては、 補足図3を参照してください)。

4. データの抽出と分析

1. 測定が完了したら、分析ソフトウェアで対応する実験を開きます。
2. 苗木の蛍光を分析するには、苗木が配置されている領域を覆う粗い(トレイ)マスクと、目的の組織(通常は子葉)のみを覆う精密な(植物)マスクの2種類のマスクを生成します。
3. トレイマスクを生成するには、[ Create New Tray Type ]オプションをクリックします。プレート画像上のそれぞれの領域に適切な遺伝子型名を割り当てます。
4. 遺伝子型を割り当てるには、[ ラウンド ]で画像番号を選択し、画面上部の[ 画像の読み込み ]をクリックします。プレートの画像が画面に表示されます。さまざまな形状描画ツールを表す一連のボタンのいずれかをクリックして(補足図4)、プレート画像に関心のある領域を描画できる 新しい形状モード に入ります。必要な領域(プレート上の異なる遺伝子型など)を選択し、適切な名前を付けます。
5. [ Esc ]をクリックして、形状モードを終了します。生成されたトレイマスクを(名前を付けた後で)保存するには、[ トレイタイプの保存]をクリックします。
6. ステップに戻り、前のステップで生成したマスクを「 トレイタイプで変更 」オプションから名前を選択して適用します。
7. プラントマスクを高精度に生成するには、180分の測定後に取得した画像(ラウンド91)を使用して、蛍光シグナル強度の最小閾値を設定し、バックグラウンドノイズを減算できるようにします。このためには、 Auto Threshold からチェックマークを外し、 Manual Threshold を0に設定します(補足図4)。
8. [プレビュー]をクリックして、トレイマスクがプレート画像上の必要なすべての領域(遺伝子型)をカバーしていることを確認します。このためには、ラウンド 91 を選択し、[プレビューの更新]をクリックします。
9. [ 実行] をクリックして [実行] メニューに入ります。ラウンド91のみにティックを配置して、ラウンド91のみの分析を実行します。次に、出力パスを選択し、[ 分析の開始] をクリックします。
10. 分析が終了すると、[完了]メニューが自動的に開きます。実行されたラウンドを実験から選択し(唯一のラウンドになります)、アナ ライザーを分析データに切り替え て、この特定の時点(ラウンド91)のデータをエクスポートします。
11. エクスポートされたアーカイブから .xsel ファイルを抽出します。このファイルには重要なプラントマスク情報が含まれているため、「 エクスポート部品を開く」(Open Export Part ) アイコンをクリックします。
12. [ ローカル解析パーツを開く ]アイコンをクリックして、実験を再度開きます。 [Mask Builder ] メニューを再度開き、[ Load Image] をクリックして [round 1] を選択し、画面の右上隅にある [ Load from File ] を選択して、以前に抽出した .xsel ファイルを読み込みます。トレイマスクが適用されたプレートの画像が表示されます。
13. 「 トレイタイプを保存 」をクリックしてマスクを保存し、「 トレイタイプで変更 」オプションでマスクの名前を選択して適用します。
14. 蛍光シグナル強度の閾値を調整して植物マスクを生成します。[Preview]メニューで生成されたマスクが各遺伝子型のROI(子葉など)に完全に適合するまで、[Manual Threshold]の値を増やします(補足図4)。プレビューメニューでラウンド全体をスクロールして、マスクが測定のすべてのラウンドに適合するかどうかを確認します(ラウンド1、61、および121での適切なマスク位置を確認するだけで十分です)。
15. すべての測定ラウンドに対して分析を実行し、データをエクスポートします。
    注:出力ファイルには、各時点の特定の遺伝子型のクロロフィル蛍光値が含まれているため、選択したチャートを作成し、さらなる統計的評価を容易にします。

結果

野生型(WT)の生態型Columbia-0(Col-0)の4日齢の脱エチオレーションシロイヌナズナの苗木において、新たに開発された手順を用いて得られた典型的な出力を図3に示します。対照条件(DMSO添加MS培地)下では、クロロフィル生合成曲線はクロロフィル合成の最初のバーストから始まり、成長のスコトモルフォ形成段階で合成されたプロトクロルフィリドプールは、光によっ...

ディスカッション

プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ-ライトなしとマスクの世話
上記のプロトコルの説明で直接強調されているように、エチオレートされた植物の苗の栽培中またはプロトコルを開始する直前の両方で、微量の光さえも避けることは非常に重要です¹¹。私たちのセットアップでは、ウォークインフィトトロンに配置され、光密回転ドアでフ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM