シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

要約

ここでは、 シロイヌナズ ナの苗木の脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成モニタリング用に設計された高度なツールについて説明します。この新しい方法論は、高い空間分解能と時間分解能で非侵襲的なリアルタイムクロロフィル蛍光イメージングを提供します。

要約

クロロフィルの生合成は、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階の1つである脱エチオール化の特徴です。クロロフィル生合成の厳密に制御された非常にダイナミックなプロセスは、顕花植物の暗闇から光への移行中に引き起こされます。エチオレートされた苗木が日光の最初の痕跡にさらされた瞬間に、プロトクロロフィリドからクロロフィリドへの急速な(秒順の)変換は、ユニークな光受容タンパク質複合体によって媒介され、その後の代謝ステップを介して完全に機能するクロロフィルの生産につながります。クロロフィル含有量分析の標準的な手法には、剥離した植物組織からの色素抽出が含まれますが、このような高速プロセスの研究には適用されません。光誘起脱エチオレーション後の最初の数時間で、 生体内の クロロフィル動態を高精度かつ時空間分解能で調査するために、装置とプロトコルが開発されました。ここでは、 シロイヌナズ ナの脱エチオレーションの初期段階におけるクロロフィルの統計的に頑健な定量のために設計された詳細な手順を紹介します。

概要

脱エチオレーションは、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階であり、多くの形態学的変化と植物代謝の完全な再編成(ヘテロから自己熱帯へ)を特徴としています¹。クロロフィルの生合成は、植物における光による脱エチオール化の特徴であり、非常にダイナミックなプロセスです。暗色で産生された前駆体プロトクロロフィリドからのクロロフィルの形成は、反応性副生成物による損傷を避けるために緊密に調整する必要があります²。プロトクロロフィリドのクロロフィリドへの還元は、光によって直接活性化されるユニークな酵素である光依存性プロトクロロフィリド酸化還元酵素(POR)によって触媒されます。反応は非常に速く、msから^{s 3}のオーダーで起こり、苗^の照射後数分以内に認識可能なクロロフィルの蓄積をもたらす^4,5,6。葉緑体生合成が完全に機能する光合成装置^{を確立する}には、より多くの時間(数時間から数日)が必要である3。

クロロフィル含有量の分析には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や分光光度法など、さまざまな方法があります。通常、こ....

プロトコル

1. 培地の調製

1. ガラス瓶にゲル化剤0.75gと滅菌脱イオン水50mLを混合し、ペトリプレート1枚(120×120×17mm)に対して1.5%(w/v)の濃度となるように培養培地を調製する。混合物を静かに振ってから、沸騰するまで電子レンジで加熱してゲル化剤を溶かします(溶液が透明になります)。
2. 次のステップに進む前に、培地を58〜60°Cまで冷ましてください。その後のすべてのステップは、汚染を防ぐために、層流フード内の無菌条件下で実行する必要があります。
3. 測定中の過度の活性光反射や高いバックグラウンド自家蛍光を避けるために、遮光性エッジを備えたペトリプレートを使用してください。このためには、黒い粘着テープ(または利用可能な他の手段)を貼り付けて、空のペトリプレートのすべての側面を覆います(図2)。
4. テープ貼付後、殺菌剤UVランプを20〜30分間照射してプレートの滅菌を行います。
5. 実験に化学的処理(すなわち、非生物的/生物的ストレッサー、植物ホルモンおよび/または成長調節剤など)が含まれる場合は、対応する化学物質を適切な量で培地に直接添加します。選択した化学的安定性が培地に添加されることに注意してください(たとえば、化学物質が熱安定性でない場合は、プレートに注ぐ直前に培地が冷却されたときに培地に添加します)。薬品が均一に分布するように、振とう....

ディスカッション

プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ-ライトなしとマスクの世話
上記のプロトコルの説明で直接強調されているように、エチオレートされた植物の苗の栽培中またはプロトコルを開始する直前の両方で、微量の光さえも避けることは非常に重要です¹¹。私たちのセットアップでは、ウォークインフィトトロンに配置され、光密回転ドアでフ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM