애기장대 탈에티올화의 초기 단계 동안 엽록소 생합성 역학 측정을 위한 비침습적 분석

요약

여기에서는 애기장대 묘목 탈에티올화의 초기 단계에서 엽록소 생합성 모니터링을 위해 설계된 고급 도구에 대해 설명합니다. 이 새로운 방법론은 높은 공간 및 시간 분해능에서 비침습적 실시간 엽록소 형광 이미징을 제공합니다.

초록

엽록소 생합성은 식물 수명 주기에서 가장 극적인 단계 중 하나인 탈에티올화의 특징입니다. 엽록소 생합성의 엄격하게 제어되고 매우 역동적인 과정은 현화 식물에서 어둠에서 빛으로 이동하는 동안 촉발됩니다. 에티올화된 묘목이 햇빛의 첫 번째 흔적에 노출되는 순간, 프로토클로로필라이드가 클로로필라이드로 빠르게(초 순서로) 전환되는 것은 독특한 빛을 받아들이는 단백질 복합체에 의해 매개되어 후속 대사 단계를 통해 완전한 기능의 엽록소 생산으로 이어집니다. 엽록소 함량 분석을 위한 표준 기법에는 분리된 식물 조직에서 색소를 추출하는 것이 포함되는데, 이는 이러한 빠른 과정을 연구하는 데 적용되지 않습니다. 빛에 의한 탈에티올레이션 후 처음 몇 시간 동안 높은 정확도와 시공간 분해능으로 in vivo 엽 록소 역학을 조사하기 위해 기기와 프로토콜이 개발되었습니다. 여기에서는 애기장대 탈에티올화의 초기 단계에서 엽록소의 통계적으로 강력한 정량화를 위해 고안된 자세한 절차를 제시합니다.

서문

탈에티올레이션(de-etiolation)은 식물 생애 주기에서 가장 극적인 단계를 나타내며, 식물 대사의 여러 형태학적 변화와 완전한 재배열(이질영양에서 자가수로)^을 특징으로 합니다1. 엽록소 생합성은 식물에서 빛에 의한 탈에티올화의 특징이며 매우 역동적인 과정입니다. 어둡게 생성된 전구체 프로토클로로필라이드(protochlorophyllide)로부터의 엽록소 형성은 반응성 부산물로 인한 손상을 피하기 위해 긴밀하게 조정되어야 한다². 클로로필라이드로의 프로토클로로필라이드 환원은 빛에 의해 직접 활성화되는 독특한 효소인 광 의존성 프로토클로로필라이드 산화환원효소(POR)에 의해 촉매됩니다. 반응은 매우 빠르며, ms 내지 s³ 의 순서로 일어나며, 에티올화 묘목 조사 ^4,5,6 후 몇 분 이내에 인식 가능한 엽록소 축적을 유도한다. 엽록체 생물 발생이 완전한 기능을 하는 광합성 장치를 확립하기 위해서는 더 많은 시간(몇 시간에서 며칠)이 필요하다³.

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프로토콜

1. 배지 준비

1. 유리병에 겔화제 0.75g과 멸균 탈이온수 50mL를 혼합하여 페트리 플레이트(120 x 120 x 17mm) 1개에 대해 1.5%(w/v) 농도를 달성하여 배양 배지를 준비합니다. 혼합물을 부드럽게 흔든 다음 겔화제가 녹을 때까지 끓을 때까지 전자레인지에 가열합니다(용액이 투명해짐).
2. 다음 단계를 진행하기 전에 매체를 58-60°C로 식히십시오. 모든 후속 단계는 오염을 방지하기 위해 층류 후드 내의 멸균 조건에서 수행해야 합니다.
3. 측정 중 과도한 광선 광 반사와 높은 배경 자가형광을 피하기 위해 빛이 새지 않는 가장자리가 있는 페트리 플레이트를 사용하십시오. 이를 위해 검은색 접착 테이프(또는 사용 가능한 다른 방법)를 적용하여 빈 페트리 플레이트의 모든 면을 덮습니다(그림 2).
4. 테이프를 붙인 후 살균제 UV 램프를 20-30분 동안 조사하여 플레이트를 살균합니다.
5. 실험에 화학적 처리(예: 비생물적/생물적 스트레스 요인, 식물 호르몬 및/또는 성장 조절제 등)가 포함된 경우 적절한 양의 해당 화학 물질을 배지에 직접 첨가합니다. 선택한 화학적 안정성이 매체에 추가되는지 알고 있어야 합니다(예: 화학 ....

토론

프로토콜 및 문제 해결의 중요한 단계 - 빛이 없고 마스크를 관리하십시오.
위의 프로토콜 설명에서 직접 강조한 바와 같이, 에티올화된 식물 묘목을 재배하는 동안 또는 프로토콜을 시작하기 직전에 미량의 빛조차도 피하는 것이 매우 중요하다¹¹. 이 설정에서는 워크인 파이토트론에 위치한 전용 다크 챔버를 사용하고 차광 회전 도어를 사용하여 나머지 파이토트.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM