Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Özet

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Özet

Klorofil biyosentezi, bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamalardan biri olan de-etiolasyonun ayırt edici özelliğidir. Sıkı bir şekilde kontrol edilen ve son derece dinamik olan klorofil biyosentezi süreci, çiçekli bitkilerde karanlıktan aydınlığa geçiş sırasında tetiklenir. Etiollü fidelerin güneş ışığının ilk izlerine maruz kaldığı anda, protoklorofilidin klorofilide hızlı (saniye sırasına göre) dönüşümüne, sonraki metabolik adımlarla tamamen işlevsel klorofil üretimine yol açan benzersiz ışık kabul eden protein kompleksleri aracılık eder. Klorofil içerik analizi için standart teknikler, bu tür hızlı işlemlerin incelenmesi için geçerli olmayan, ayrılmış bitki dokularından pigment ekstraksiyonunu içerir. Klorofil kinetiğini, ışık kaynaklı de-etiolasyondan sonraki ilk saatlerde yüksek doğruluk ve uzay-zamansal çözünürlükle in vivo olarak araştırmak için bir alet ve protokol geliştirilmiştir. Burada, Arabidopsis de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofilin istatistiksel olarak sağlam miktar tayini için tasarlanmış ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz.

Giriş

De-etiolasyon, bir dizi morfolojik değişiklik ve bitki metabolizmasının tamamen yeniden düzenlenmesi (hetero-tropikten oto-tropik)¹ ile karakterize edilen bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamayı temsil eder. Klorofil biyosentezi, bitkilerde ışığa bağlı de-etiolasyonun ve çok dinamik bir sürecin ayırt edici özelliğidir. Koyu renkli üretilen öncü protoklorofilden klorofil oluşumu, reaktif yan ürünlerden kaynaklanan hasarı önlemek için sıkı bir şekilde koordine edilmelidir². Protoklorofilidin klorofide indirgenmesi, doğrudan ışıkla aktive edilen benzersiz enzimler olan ışığa bağımlı protoklorofil oksidoredüktazlar (POR....

Protokol

1. Orta hazırlık

1. Bir Petri plakası (120 x 120 x 17 mm) için% 1.5 (a / h) konsantrasyon elde etmek için 0.75 g jelleştirici maddeyi 50 mL steril deiyonize su ile bir cam şişede karıştırarak yetiştirme ortamını hazırlayın. Karışımı hafifçe çalkalayın ve ardından jelleştirici maddeyi çözmek için kaynayana kadar bir mikrodalgada ısıtın (çözelti berraklaşır).
2. Sonraki adımlara geçmeden önce ortamın 58-60 °C'ye soğumasını bekleyin. Sonraki tüm adımlar, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı bir başlık içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
3. Ölçümler sırasında aşırı aktinik ışık yansımasını ve yüksek arka plan o....

Tartışmalar

Protokolün kritik adımları ve sorun giderme - ışık yok ve maskeye dikkat edin
Yukarıdaki protokol açıklamasında doğrudan vurgulandığı gibi, hem etiollenmiş bitki fidelerinin yetiştirilmesi sırasında hem de protokole başlamadan hemen önce eser miktarda ışıktan bile kaçınmak kritik öneme sahiptir¹¹. Kurulumumuzda, içeri giren fitotronda bulunan ve fitotronun geri kalanından ışık geçirmez dönen kapı ile ayrılmış özel bir karanlık oda kullanı.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM