Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Özet

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Özet

Klorofil biyosentezi, bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamalardan biri olan de-etiolasyonun ayırt edici özelliğidir. Sıkı bir şekilde kontrol edilen ve son derece dinamik olan klorofil biyosentezi süreci, çiçekli bitkilerde karanlıktan aydınlığa geçiş sırasında tetiklenir. Etiollü fidelerin güneş ışığının ilk izlerine maruz kaldığı anda, protoklorofilidin klorofilide hızlı (saniye sırasına göre) dönüşümüne, sonraki metabolik adımlarla tamamen işlevsel klorofil üretimine yol açan benzersiz ışık kabul eden protein kompleksleri aracılık eder. Klorofil içerik analizi için standart teknikler, bu tür hızlı işlemlerin incelenmesi için geçerli olmayan, ayrılmış bitki dokularından pigment ekstraksiyonunu içerir. Klorofil kinetiğini, ışık kaynaklı de-etiolasyondan sonraki ilk saatlerde yüksek doğruluk ve uzay-zamansal çözünürlükle in vivo olarak araştırmak için bir alet ve protokol geliştirilmiştir. Burada, Arabidopsis de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofilin istatistiksel olarak sağlam miktar tayini için tasarlanmış ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz.

Giriş

De-etiolasyon, bir dizi morfolojik değişiklik ve bitki metabolizmasının tamamen yeniden düzenlenmesi (hetero-tropikten oto-tropik)¹ ile karakterize edilen bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamayı temsil eder. Klorofil biyosentezi, bitkilerde ışığa bağlı de-etiolasyonun ve çok dinamik bir sürecin ayırt edici özelliğidir. Koyu renkli üretilen öncü protoklorofilden klorofil oluşumu, reaktif yan ürünlerden kaynaklanan hasarı önlemek için sıkı bir şekilde koordine edilmelidir². Protoklorofilidin klorofide indirgenmesi, doğrudan ışıkla aktive edilen benzersiz enzimler olan ışığa bağımlı protoklorofil oksidoredüktazlar (POR'lar) tarafından katalize edilir. Reaksiyon çok hızlıdır, ms ila s³ sırasına göre gerçekleşir ve etiollü fide ışınlamasından birkaç dakika sonra^tanınabilir klorofil birikimine yol açar ^4,5,6. Kloroplast biyogenezinin tamamen işlevsel bir fotosentetik aparat oluşturması için daha fazla zaman (saatlerden günlere) gerekir³.

Klorofil içeriğini analiz etmek için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) veya spektrofotometri dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. Genellikle, bu teknikler bitki dokusunun ^4,5,6 tahrip edilmesini gerektirir ve zaman içinde klorofil seviyelerindeki değişikliklerin belirlenmesini kısıtlar. Non-invaziv klorofil kinetiğinin kurulmasına izin veren yöntemler, zaman ve mekanda klorofil sentezi sürecini analiz etmek gibi temel araştırma sorularından, stres toleransının değerlendirilmesi veya biyostimülanların klorofil kinetiği üzerindeki etkisi gibi daha pratik uygulamalara kadar çeşitli yönlerden bitkileri incelemek için yepyeni bir bakış açısı açabilir. Bunu göz önünde bulundurarak, klorofil oluşumunu izlemek için bir sistem olan iReenCAM^7'yi tanıttık. Bir CCD kamera, emisyon filtreleri, ışık kaynakları ve otomatik floresan analizi için bir boru hattı içerir (Şekil 1). Geliştirilen cihazın temel özelliği, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük, mevcut yaklaşımlarda kullanılan parametrelerde daha iyi performans göstermesi ve standart analitik yöntemlerle karşılaştırıldığında yeterli hassasiyet ve özgüllüktür⁷.

Burada tarif edilen non-invaziv prosedür, minimum reaktifler gerektirir ve de-etiolasyonun çok erken aşamalarında canlı Arabidopsis fidelerinde bir klorofil kinetik profili elde edilmesine izin veren basit adımlardan oluşur. Protokol, hem eksojen (tuz, kuraklık, biyostimülanlar, ağır metaller, vb.) hem de endojen (tipik olarak gen aktivitesindeki değişikliklerle ilişkili) faktörlerden etkilenen klorofil sentezinin son derece dinamik sürecinin incelenmesi için yararlı olabilir.

Protokol

1. Orta hazırlık

1. Bir Petri plakası (120 x 120 x 17 mm) için% 1.5 (a / h) konsantrasyon elde etmek için 0.75 g jelleştirici maddeyi 50 mL steril deiyonize su ile bir cam şişede karıştırarak yetiştirme ortamını hazırlayın. Karışımı hafifçe çalkalayın ve ardından jelleştirici maddeyi çözmek için kaynayana kadar bir mikrodalgada ısıtın (çözelti berraklaşır).
2. Sonraki adımlara geçmeden önce ortamın 58-60 °C'ye soğumasını bekleyin. Sonraki tüm adımlar, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı bir başlık içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
3. Ölçümler sırasında aşırı aktinik ışık yansımasını ve yüksek arka plan otofloresansını önlemek için ışık geçirmez kenarlı Petri plakaları kullanın. Bunun için, boş Petri plakasının tüm kenarlarını kaplayacak şekilde siyah yapışkan bant (veya mevcut diğer araçlar) uygulayın (Şekil 2).
4. Bant uygulamasından sonra 20-30 dakika boyunca mikrop öldürücü UV lambası ile ışınlanarak plaka(lar)ın sterilizasyonunu gerçekleştirin.
5. Deney kimyasal işlem içeriyorsa (yani, abiyotik/biyotik stres faktörleri, bitki hormonları ve/veya büyüme düzenleyiciler, vb.), uygun miktarda karşılık gelen kimyasalı doğrudan ortama ekleyin. Ortama eklenen seçilmiş bir kimyasal stabilitenin farkında olun (örneğin, kimyasal termostabil değilse, plakaya dökmeden hemen önce soğuduğunda ortama ekleyin). Kimyasalın eşit dağılımını sağlamak için ortamı çalkalayarak iyice karıştırın.
6. Ortam döküldükten sonra plakaların UV ışığına aydınlatılmasından kaçının (deneye müdahale edebilecek oksijen radikali üretimine yol açar).
7. Hazırlanan besiyerini kare Petri tabağına/plakalarına dökün ve besiyerinin oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.

2. Tohum yüzey sterilizasyonu ve bitki büyüme koşulları

1. Gerekli miktarda Arabidopsis thaliana Col-0 tohumunu stok balkından (10-20 mg) alın ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
   NOT: Farklı Arabidopsis hatlarıyla (ekotip/mutant hatlar) çalışırken belirli bir değişiklik gerekli değildir. Testere ızgarasının revizyonu ve ölçüm adımları, tohum büyüklüğü, çimlenme oranı ve fide büyüklüğündeki farklılıklar dikkate alınarak diğer bitki türleri için yapılmalıdır.
2. Arabidopsis tohumlarını tüpe 2 dakika boyunca %70 etanol ekleyerek yüzey sterilize edin. Sterilizasyon sırasında tüpleri hafifçe sallayın.
3. Etanolü dikkatlice pipetleyerek çıkarın, tohumları kaybetmemeye dikkat edin. Kalan etanolü çıkarmak için tüpe 5 dakika steril su ekleyerek tohumları yıkayın (yıkama süresi boyunca tüpleri hafifçe sallayın).
4. Tohumların yerçekimi ile tüpün dibine çökmesine izin verin, kalan suyu çıkarın.
5. Herhangi bir etanol özelliğinden arınmış olduklarından emin olmak için tohumları adım 2.3'te açıklandığı gibi tekrar 2 kez steril suyla durulayın. Tohumların yerçekimi ile tüpün dibine çökmesine izin verin, kalan suyu çıkarın.
6. Bir tohum suyu süspansiyonu oluşturmak için tohumları içeren tüpe eşit miktarda steril su ekleyin.
7. Verilen genotipin tohum-su süspansiyonunu orta plakanın seçilen alanlarına eşit olarak dağıtmak için bir ekim ızgarası kullanın (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Tohumları (yaklaşık 30-40) geniş bir pipet ucu kullanarak her alana arka arkaya dağıtın.
8. Tohum alanlarında suyun yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin, kontaminasyonu önlemek için plaka(lar)ı laminer akış başlığında açık tutun. Plakayı mikro gözenekli bantla kapatın ve alüminyum folyo ile sarın.
9. (Kullanılan ekotipe bağlı olarak) tohum uyku halinin üstesinden gelmek ve/veya homojen çimlenmeyi teşvik etmek için tohumları karanlıkta 3 gün boyunca 4 °C'de katmanlandırın.
10. Tabakalı tohumlu plakayı beyaz ışığa (150 μmol/^m2/s) 1 saat boyunca çimlenmeyi indüklemek için aktarın (folyoyu yalnızca ışık işlemi için açın).
11. Işık işleminden sonra, tohumları ışıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile sarın ve bir büyüme odasına dikey bir konuma yerleştirin ve karanlıkta 21 ° C'de 4 gün boyunca yetiştirin.

3. Klorofil floresan ölçümü ve analizi

1. iReenCAM sistemini açın ve sistemin hazır olduğundan ve otomatik olarak başlatılan PS sunucu yazılımında doğru şekilde yapılandırıldığından emin olun (örneğin, deney verileri için yeterli depolama alanı varsa, floresan kamera PC'ye bağlıysa vb.).
2. Denemeler > Yeni Deneme'ye tıklayarak ölçüm için deney planı oluşturmak üzere Zamanlayıcı yazılımını etkinleştirin. Deneme için açıklayıcı bir ad girin ve ayrıntıları (açıklama) doldurun.
3. Deneme eylemlerinin zamanlamasına yol açacak olan İşlem Ekle'yi tıklayarak deneme için gerekli eylemleri ayarlayın.
   NOT: Buradaki eylem kelimesi, tam bir deney yapmak anlamına gelir (yani, bir plaka ölçümü yapmak için gerekli tüm adımları içerir).
4. Tek bir yuvarlak ölçüm için koşulları belirtin (yani, aydınlık/karanlık periyodunun uzunluğu).
5. Liste Oluştur'a tıklayarak, ölçüm turları arasındaki zaman aralıklarını tanımlayın. Turun başlayacağı ve biteceği zamanı (toplam 4 saat) ve turlar arasındaki aralıkları (mevcut kurulumda her 2 dakikada bir tur) seçin.
6. Oluştur'a tıklayın ve ekranın sol tarafında oluşturulan listeyi kontrol ederek ışık darbeleri arasındaki zaman çerçevesinin ve aralıkların doğru olduğundan emin olun.
7. Ölçüm protokolünü seçin (Ek Şekil 2). İleride başvurmak üzere tüm değişiklikleri veritabanına kaydedin.
8. Ölçüm başlamadan hemen önce, karanlık odanın içinde düşük yoğunluklu yeşil ışık kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve folyoyu Petri plakasından çıkarmadan önce ölçüm odasının içindeki rafın seviyesini ayarlayın veya diğer hazırlık adımlarını gerçekleştirin. Ardından ışığı kapatın ve plakaları tamamen karanlıkta ölçüm odasına aktarın.
9. 4 günlük fideleri içeren Petri plakasını kaplayan alüminyum folyoyu dikkatlice çıkarın. Petri plakasını cihaz ölçüm odasının içine yatay olarak yerleştirin. Odanın içinde, aktinik ışık darbelerini indükleyin ve 3.1-3.7 adımlarında belirlenen deney planına (eylemlere) göre görüntüleme yapın.
   NOT: Plakaları ölçüm odasına yerleştirmeden önce etiollü fidelerle aydınlatılmaktan kaçınmak çok önemlidir. Etiollü fidelerin bulunduğu plaka ile manipülasyon karanlık odada/odada yapılmalıdır (olası bir deney düzeneği için Ek Şekil 3'e bakınız).

4. Veri çıkarma ve analiz

1. Ölçümü tamamladıktan sonra, analizör yazılımında ilgili deneyi açın.
2. Fidelerin floresansını analiz etmek için iki tür maske oluşturun - fidelerin bulunduğu alanı kaplayan kaba (tepsi) bir maske ve yalnızca ilgilenilen dokuyu (tipik olarak kotiledonlar) kaplayan hassas bir (bitki) maske.
3. Yeni Tepsi Türü Oluştur seçeneğini tıklatarak bir tepsi maskesi oluşturun. Plaka görüntüsündeki ilgili alanlara uygun genotip adlarını atayın.
4. Genotip atamak için, Yuvarlak'ta bir görüntü numarası seçin ve ardından ekranın üst kısmındaki Resmi Yükle'ye tıklayın. Plakanın görüntüsü ekranda gösterilecektir. Farklı şekiller çizim araçlarını temsil eden düğme setlerinden herhangi birine tıklayarak (Ek Şekil 4), plaka görüntüsünde ilgi alanını çizmeye izin veren Yeni Şekil Moduna girin. Gerekli alanları seçin (örneğin, plakadaki farklı genotipler) ve uygun isimlendirmelerini sağlayın.
5. Şekil modundan çıkmak için Esc tuşuna tıklayın. Oluşturulan tepsi maskesini kaydedin (bir ad verdikten sonra) Tepsi Türünü Sakla'yı tıklatarak.
6. Bir adım geri gidin ve Tepsi Türüne Göre Değiştir seçeneğinden adını seçerek önceki adımlarda oluşturulan maskeyi uygulayın.
7. Bitki maskesini yüksek doğrulukla oluşturmak için, floresan sinyal yoğunluğu için minimum eşik değerini ayarlamak için 180 dakikalık ölçümden (yuvarlak 91) sonra elde edilen görüntüyü kullanın ve arka plan gürültüsünün çıkarılmasını sağlayın. Bunun için Otomatik Eşik'ten onay işaretini kaldırın ve Manuel Eşiği 0 olarak ayarlayın (Ek Şekil 4).
8. Tepsi maskesinin plaka görüntüsündeki tüm gerekli alanları (genotipler) kapsadığından emin olmak için Önizleme'ye tıklayın. Bunun için 91. turu seçin ve Önizlemeyi Yenile'ye tıklayın.
9. Çalıştır'a tıklayarak Çalıştır menüsüne girin. Sadece 91. turda bir onay işareti koyarak analizi yalnızca 91. tur için çalıştırın. Ardından çıkış yolunu seçin ve Analizi Başlat'a tıklayın.
10. Analiz bittikten sonra Bitir menüsü otomatik olarak açılacaktır. Deneylerden yürütülen turu (tek tur olacaktır) seçin ve bu belirli zaman noktası (91. tur) için verileri dışa aktarmak için Analizörü Analiz Edilen Verilere Değiştir'e tıklayın.
11. .xsel dosyasını dışa aktarılan arşivden ayıklayın, çünkü bu dosya Dışa Aktarma Bölümünü Aç simgesine tıklayarak temel bitki maskesi bilgilerini içerir.
12. Yerel Analiz Bölümünü Aç simgesine tıklayarak denemeyi yeniden açın. Maske Oluşturucu menüsüne tekrar girin, Görüntü Yükle'ye tıklayın, yuvarlak 1'i seçin ve ardından ekranın sağ üst köşesindeki Dosyadan Yükle'yi seçin ve önceden çıkarılan .xsel dosyasını yükleyin. Tepsi maskesi uygulanmış olarak plakanın görüntüsü gösterilecektir.
13. Tepsi Türünü Sakla'yı tıklatarak maskeyi kaydedin ve Tepsi Türüne Göre Değiştir seçeneğinde adını seçerek uygulayın.
14. Floresan sinyal yoğunluğu eşiğini ayarlayarak bitki maskesini oluşturun. Önizleme menüsünde oluşturulan maske, genotiplerin her birindeki ROI'ye (örn. kotiledonlar) mükemmel şekilde uyana kadar Manuel Eşik değerini artırın (Ek Şekil 4). Önizleme menüsünde turlar boyunca kaydırarak maskenin ölçümlerin tüm turlarına uyup uymadığını kontrol edin (1, 61 ve 121. turlarda uygun maske konumunu kontrol etmek yeterli olacaktır).
15. Tüm ölçüm turları için analiz gerçekleştirin ve verileri dışa aktarın.
    NOT: Çıktı dosyası, her bir zaman noktası için belirli bir genotipin klorofil floresan değerlerini içerir, bu da seçim çizelgelerinin oluşturulmasını sağlar ve daha fazla istatistiksel değerlendirmeyi kolaylaştırır.

Sonuçlar

Yabani tip (WT), ekotip Columbia-0 (Col-0) 4 günlük etiolasyondan arındırılmış Arabidopsis fidelerinde yeni geliştirilen prosedür kullanılarak elde edilen tipik çıktı Şekil 3'te gösterilmektedir. Kontrol koşulları altında (DMSO takviyeli MS ortamı), klorofil biyosentetik eğrisi, büyümenin skotomorfojenik fazı sırasında sentezlenen protoklorfilid havuzunun, ışıkla indüklenen POR'lar ^7,8,9

Tartışmalar

Protokolün kritik adımları ve sorun giderme - ışık yok ve maskeye dikkat edin
Yukarıdaki protokol açıklamasında doğrudan vurgulandığı gibi, hem etiollenmiş bitki fidelerinin yetiştirilmesi sırasında hem de protokole başlamadan hemen önce eser miktarda ışıktan bile kaçınmak kritik öneme sahiptir¹¹. Kurulumumuzda, içeri giren fitotronda bulunan ve fitotronun geri kalanından ışık geçirmez dönen kapı ile ayrılmış özel bir karanlık oda kullanı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM