قياس طول ذيل بولي أ من دماغ يرقة ذبابة الفاكهة وخط الخلية

Summary

يصف البروتوكول طريقة فعالة وموثوقة لتحديد طول poly(A) للجين محل الاهتمام من الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة ، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع الأنسجة أو أنواع الخلايا من الأنواع الأخرى.

Abstract

Polyadenylation هو تعديل حاسم بعد النسخ يضيف ذيول poly (A) إلى الطرف 3 'من جزيئات mRNA. يتم تنظيم طول ذيل poly (A) بإحكام بواسطة العمليات الخلوية. ارتبط عدم تنظيم polyadenylation mRNA بالتعبير الجيني غير الطبيعي وأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية وتشوهات النمو. لذلك ، فإن فهم ديناميكيات polyadenylation أمر حيوي لكشف تعقيدات معالجة mRNA وتنظيم الجينات بعد النسخ.

يقدم هذا البحث طريقة لقياس أطوال ذيل poly (A) في عينات الحمض النووي الريبي المعزولة من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة وخلايا ذبابة الفاكهة شنايدر S2. استخدمنا نهج مخلفات جوانوزين / إينوزين (G / I) ، والذي يتضمن الإضافة الأنزيمية لبقايا G / I في نهاية 3 'من mRNA باستخدام بوليميراز الخميرة بولي (A). يحمي هذا التعديل نهاية الحمض النووي الريبي 3 'من التدهور الأنزيمي. ثم يتم نسخ ذيول poly (A) المحمية كاملة الطول بشكل عكسي باستخدام طبقة أولية عالمية مضادة للحساسية. بعد ذلك ، يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام oligo خاص بالجين يستهدف الجين محل الاهتمام ، جنبا إلى جنب مع oligo تسلسل عالمي يستخدم للنسخ العكسي.

هذا يولد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تشمل ذيول بولي (أ) للجين محل الاهتمام. نظرا لأن polyadenylation ليس تعديلا موحدا وينتج عنه ذيول بأطوال متفاوتة ، فإن منتجات PCR تعرض مجموعة من الأحجام ، مما يؤدي إلى نمط تشويه على هلام الأغاروز. أخيرا ، تخضع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي للهلام الشعري عالي الدقة ، يليه القياس الكمي باستخدام أحجام منتجات poly (A) PCR ومنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجينات. توفر هذه التقنية أداة مباشرة وموثوقة لتحليل أطوال ذيل poly (A) ، مما يمكننا من اكتساب رؤى أعمق حول الآليات المعقدة التي تحكم تنظيم mRNA.

Introduction

معظم mRNAs حقيقية النواة هي polyadenylated بعد النسخ في نهايتها 3 ′ في النواة عن طريق إضافة الأدينوزينات غير المقولبة بواسطة بوليميراز بولي (A) الكنسي. يعد ذيل poly (A) السليم محوريا طوال دورة حياة mRNA ، لأنه ضروري لتصدير mRNA^{النووي 1} ، ويسهل التفاعل مع البروتينات المرتبطة ب poly (A) لتعزيز الكفاءة الانتقالية² ، ويضفي مقاومة ضد التدهور³. في بعض الحالات، يمكن أن يخضع ذيل بولي (أ) أيضا للتمدد في السيتوبلازم، الذي تسهله بوليميراز بولي (أ) غير المتعارف عليه⁴. في السيتوبلازم ، يتغير طول ذيل بولي (A) ديناميكيا ويؤثر على العمر الافتراضي لجزيء mRNA. تشتهر العديد من البلمرة و deade....

Protocol

1. تربية واختيار يرقات ذبابة الفاكهة

1. الحفاظ على / استزراع سلالة الذباب (w¹¹¹⁸ ، wildtype) على وسط طعام الذباب القياسي عند 25 درجة مئوية في حاضنة مرطبة.
2. حدد 10 تجول 3 يرقات^{داخلية بعد} 72 ساعة من وضع البيض.
3. ضع اليرقات في طبق بتري فارغ 35 مم واغسلها برفق عن طريق نقل اليرقات إلى الطبق الجديد الذي يحتوي على ماء الصنبور باستخدام ملقط. افعل هذا 2x لإزالة أي طعام متبقي.

2. عزل الدماغ من يرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 1)

النتائج

هنا ، قمنا بتحليل طول ذيل poly (A) ل Dscam1 و GAPDH من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 4). تم تصور الحمض النووي الريبي المعزول على هلام الأغاروز لمراقبة الجودة. يشير نطاق الحمض النووي الريبي الواحد بحجم 600 نيوكليوتيد تقريبا إلى تحضير الحمض النووي الريبي السليم (

Discussion

في هذا البروتوكول ، نصف تقنية تشريح دماغ يرقات ذبابة الفاكهة من تجول^{3 المرحلة الداخلية} بالإضافة إلى تحضير العينة من خلايا ذبابة الفاكهة S2. نظرا للطبيعة المرنة ل mRNAs ، يتطلب جمع العينات مزيدا من الحذر. بالنسبة لتشريح دماغ اليرقات ، يجب عدم تلف الأدمغة أثناء العزلة ويجب عدم ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49