Medição do comprimento da cauda de Poly A do cérebro da larva de Drosophila e da linha celular

Resumo

O protocolo descreve um método eficiente e confiável para quantificar o comprimento poli(A) do gene de interesse do sistema nervoso de Drosophila , que pode ser facilmente adaptado a tecidos ou tipos celulares de outras espécies.

Resumo

A poliadenilação é uma modificação pós-transcricional crucial que adiciona caudas de poli(A) à extremidade 3' das moléculas de RNAm. O comprimento da cauda poli(A) é fortemente regulado por processos celulares. A desregulação da poliadenilação de RNAm tem sido associada à expressão gênica anormal e a várias doenças, incluindo câncer, distúrbios neurológicos e anormalidades do desenvolvimento. Portanto, compreender a dinâmica da poliadenilação é vital para desvendar as complexidades do processamento de RNAm e da regulação gênica pós-transcricional.

Este trabalho apresenta um método para medir o comprimento da cauda de poli(A) em amostras de RNA isoladas de cérebros de larvas de Drosophila e células S2 de Drosophila Schneider. Empregamos a abordagem de rejeito de guanosina/inosina (G/I), que envolve a adição enzimática de resíduos de G/I na extremidade 3' do RNAm usando poli(A) polimerase de levedura. Esta modificação protege a extremidade 3' do RNA da degradação enzimática. As caudas poli(A) de comprimento total protegidas são então transcritas reversamente usando um primer antisenso universal. Posteriormente, a amplificação por PCR é realizada usando um oligo gene-específico que tem como alvo o gene de interesse, juntamente com uma sequência universal oligo usada para transcrição reversa.

Isso gera produtos de PCR englobando as caudas poli(A) do gene de interesse. Como a poliadenilação não é uma modificação uniforme e resulta em caudas de comprimentos variados, os produtos de PCR exibem uma variedade de tamanhos, levando a um padrão de esfregaço no gel de agarose. Finalmente, os produtos de PCR são submetidos à eletroforese em gel capilar de alta resolução, seguida de quantificação usando os tamanhos dos produtos de poli(A) PCR e do produto de PCR gene-específico. Esta técnica oferece uma ferramenta simples e confiável para analisar comprimentos de cauda poli(A), permitindo-nos obter insights mais profundos sobre os intrincados mecanismos que governam a regulação do RNAm.

Introdução

A maioria dos mRNAs eucarióticos são pós-transcricionalmente poliadenilados, em seu término 3′ no núcleo, pela adição de adenosinas não moldadas por poli(A) polimerases canônicas. Uma cauda poli(A) intacta é fundamental durante todo o ciclo de vida do mRNA, pois é essencial para a exportação nuclear de mRNA¹, facilita a interação com proteínas ligadoras de poli(A) para aumentar a eficiência translacional² e confere resistência contra a degradação³. Em certos casos, a cauda de poli(A) também pode sofrer extensão no citoplasma, facilitada por poli(A) polimerases não^canônicas4....

Protocolo

1. Criação e seleção de larvas de Drosophila

1. Manter/cultivar a estirpe de mosca (w¹¹¹⁸, wildtype) em meio alimentar padrão a 25 °C numa incubadora humidificada.
2. Selecione 10 larvas errantes de^3º ínstar 72 h após a postura dos ovos.
3. Coloque as larvas em uma placa de Petri vazia de 35 mm e lave-as suavemente, transferindo as larvas para a nova placa contendo água da torneira usando pinças. Faça isso 2x para remover qualquer alimento restante.

2. Isolamento cerebral de larvas de Drosophila

Discussão

Neste protocolo, descrevemos a técnica para dissecar o cérebro de larvas de Drosophila do estágio errante de^3º ínstar, bem como a preparação de amostras de células de Drosophila S2. Devido à natureza lábil dos mRNAs, a coleta de amostras requer cuidado extra. Para a dissecção cerebral larval, os cérebros não devem ser danificados durante o isolamento e não devem ser mantidos em solução por um período prolongado. Manter o tempo de dissecção para 8-10 min para uma rodada de .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49