ショウジョウバエ幼虫の脳および細胞株からのPoly A尾長の測定

要約

プロトコルは他の種からのティッシュかセルのタイプに容易に合わせることができる ショウジョウバエ の神経系からの興味の遺伝子の多(A)長さを量化するための有効で、信頼できる方法を記述する。

要約

ポリアデニル化は、mRNA分子の3'末端にポリ(A)テールを付加する重要な転写後修飾です。ポリ(A)テールの長さは、細胞プロセスによって厳密に制御されています。mRNAポリアデニル化の調節不全は、遺伝子発現の異常や、がん、神経疾患、発達異常などのさまざまな疾患と関連しています。したがって、ポリアデニル化の動態を理解することは、mRNAプロセシングと転写後遺伝子制御の複雑さを解明するために不可欠です。

この論文では、 ショウジョウバエ の幼虫の脳と ショウジョウバエ のシュナイダーS2細胞から単離されたRNAサンプルのポリ(A)テールの長さを測定する方法を紹介します。私たちは、酵母ポリ(A)ポリメラーゼを用いてmRNAの3'末端にG/I残基を酵素的に付加するグアノシン/イノシン(G/I)テーリングアプローチを採用しました。この修飾により、RNAの3'末端が酵素分解から保護されます。次に、保護された全長のポリ(A)テールを、ユニバーサルアンチセンスプライマーを使用して逆転写します。続いて、逆転写に用いるユニバーサル配列オリゴとともに、目的遺伝子を標的とする遺伝子特異的オリゴを用いてPCR増幅を行う。

これにより、目的の遺伝子のポリ(A)テールを包含するPCR産物が生成されます。ポリアデニル化は均一な修飾ではなく、さまざまな長さのテールが生じるため、PCR産物はさまざまなサイズを示し、アガロースゲルに塗抹標本パターンをもたらします。最後に、PCR産物を高分解能キャピラリーゲル電気泳動にかけ、ポリ(A)PCR産物と遺伝子特異的PCR産物のサイズを用いて定量します。この手法は、ポリ(A)テールの長さを分析するための簡単で信頼性の高いツールを提供し、mRNA制御を支配する複雑なメカニズムについてより深い洞察を得ることができます。

概要

ほとんどの真核生物のmRNAは、標準的なポリ(A)ポリメラーゼによる非テンプレート化アデノシンの付加により、核内の3'末端で転写後ポリアデニル化されます。無傷のポリ(A)テールは、mRNAの^核外輸送に不可欠であり1、ポリ(A)結合タンパク質との相互作用を促進して翻訳効率を高め²、分解に対する耐性を付与する³ため、mRNAのライフサイクル全体を通じて極めて重要です。場合によっては、ポリ(A)テールは、非標準的ポリ(A)ポリメラーゼによって促進され、細胞質内で伸長する^{こともあります4。}細胞質では、ポリ(A)テールの長さが動的に変化し、mRNA分子の寿命に影響を与えます。多数のポリメラーゼおよびデデニラーゼは尾の長さ^5,6,7を調節するために知られている。例えば、ポリ(A)テールの短縮は並進抑制と相関し、ポリ(A)テールの延長^は並進抑制を増強する^8,9。

蓄積されたゲノム研究は、真核生物生物学....

プロトコル

1. ショウジョウバエ幼虫の飼育と選抜

1. ハエ株(w¹¹¹⁸、野生型)を標準的なハエの餌培地で25°Cの加湿インキュベーターで維持/培養します。
2. 産卵後72時間で放浪する3^齢 幼虫を10匹選別する。
3. 幼虫を35mmの空のシャーレに入れ、鉗子を使用して水道水を含む新しいシャーレに幼虫を移して静かに洗浄します。これを2回行って、残っている食べ物を取り除きます。

2. ショウジョウバエ幼虫からの脳分離(図1)

図1

ディスカッション

このプロトコルでは、私達はショウジョウバエS2セルからのサンプル準備と同様、第3^のinstarの段階をさまようことからのショウジョウバエの幼虫の頭脳を解剖する技術を記述する。mRNAは不安定な性質を持っているため、サンプル採取には特別な注意が必要です。幼虫の脳解剖の場合、隔離中に脳が損傷してはならず、長期間溶液中に保管しないでください。解剖のラウ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49