Drosophila Larva Brain and Cell Line의 Poly A 꼬리 길이 측정

요약

이 프로토콜은 다른 종의 조직이나 세포 유형에 쉽게 적응할 수 있는 초파리 신경계의 관심 유전자의 폴리(A) 길이를 정량화하기 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

초록

폴리아데닐화(Polyadenylation)는 mRNA 분자의 3' 말단에 폴리(A) 꼬리를 추가하는 중요한 전사 후 변형입니다. 폴리(A) 꼬리의 길이는 세포 과정에 의해 엄격하게 조절됩니다. mRNA 폴리아데닐화의 조절 장애는 비정상적인 유전자 발현 및 암, 신경 장애 및 발달 이상을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다. 따라서 폴리아데닐화의 역학을 이해하는 것은 mRNA 처리 및 전사 후 유전자 조절의 복잡성을 밝히는 데 매우 중요합니다.

이 논문은 초파리 유충 뇌와 초파리 슈나이더 S2 세포에서 분리된 RNA 샘플에서 폴리(A) 꼬리 길이를 측정하는 방법을 제시합니다. 우리는 효모 폴리(A) 중합효소를 사용하여 mRNA의 3' 말단에 G/I 잔기를 효소로 추가하는 구아노신/이노신(G/I) 테일링 접근법을 사용했습니다. 이 변형은 RNA의 3' 말단을 효소 분해로부터 보호합니다. 그런 다음 보호된 전체 길이 폴리(A) 꼬리는 범용 안티센스 프라이머를 사용하여 역전사됩니다. 이어서, PCR 증폭은 역전사에 사용되는 범용 서열 올리고와 함께 관심 유전자를 표적으로 하는 유전자 특이적 올리고를 사용하여 수행됩니다.

이것은 관심 유전자의 폴리(A) 꼬리를 포함하는 PCR 산물을 생성합니다. 폴리아데닐화는 균일한 변형이 아니고 다양한 길이의 꼬리가 생기기 때문에 PCR 산물은 다양한 크기를 표시하여 아가로스 겔에 얼룩 패턴을 유발합니다. 마지막으로, PCR 산물은 고분해능 모세관 겔 전기영동을 거친 후 폴리(A) PCR 산물 및 유전자 특이적 PCR 산물의 크기를 사용하여 정량화합니다. 이 기술은 폴리(A) 꼬리 길이를 분석하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공하여 mRNA 조절을 지배하는 복잡한 메커니즘에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.

서문

대부분의 진핵생물 mRNA는 canonical poly(A) polymerases에 의한 non-templated 아데노신의 첨가에 의해 핵의 3′ 말단에서 전사 후 폴리아데닐화됩니다. 온전한 poly(A) tail은 mRNA^{핵 내보내기에} 필수적이고1, poly(A)-결합 단백질과의 상호작용을 촉진하여 번역 효율을 높이고², 분해에 대한 저항성을 부여하기 때문에 mRNA의 수명 주기 전반에 걸쳐 중추적인 역할을^합니다3. 어떤 경우에는 poly(A) 꼬리가 세포질에서 확장될 수도 있는데, 이는 noncanonical poly(A) polymerases⁴에 의해 촉진된다. 세포질에서 폴리(A) 꼬리 길이는 동적으로 변화하고 mRNA 분자의 수명에 영향을 미칩니다. 수많은 폴리메라이제와 데데닐라아제는 꼬리 길이 ^5,6,7을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 예를 들어, poly(A) 꼬리의 짧아짐은 translational repression과 상관관계가 있는 반....

프로토콜

1. 초파리 유충 사육 및 선택

1. 가습 인큐베이터에서 25°C의 표준 플라이 식품 배지에서 플라이 균주(w¹¹¹⁸, 야생형)를 유지/배양합니다.
2. 알을 낳은 후 72시간 동안 방황하는 3^번째 인스타 유충 10마리를 선택합니다.
3. 유충을 35mm의 빈 페트리 접시에 넣고 집게를 사용하여 수돗물이 담긴 새 접시에 유충을 옮겨 부드럽게 씻습니다. 남은 음식을 제거하려면 이 작업을 2번 수행합니다.

2. 초파리 유충으로부터의 뇌 분리(그림 1)

토론

이 프로토콜에서는 방황하는 3^번째 instar 단계에서 초파리 유충 뇌를 해부하는 기술과 초파리 S2 세포의 샘플 준비에 대해 설명합니다. mRNA의 불안정한 특성으로 인해 검체 채취에는 각별한 주의가 필요합니다. 유충 뇌 해부의 경우 격리 중에 뇌가 손상되어서는 안 되며 장기간 용액에 보관해서는 안 됩니다. 해부 라운드를 위해 해부 시간을 8-10분으로 유지하는 것이 필수적입?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49