Mesure de la longueur de la queue Poly A à partir du cerveau et de la lignée cellulaire des larves de drosophile

Résumé

Le protocole décrit une méthode efficace et fiable pour quantifier la longueur poly(A) du gène d’intérêt du système nerveux de la drosophile , qui peut être facilement adaptée aux tissus ou aux types de cellules d’autres espèces.

Résumé

La polyadénylation est une modification post-transcriptionnelle cruciale qui ajoute des queues poly(A) à l’extrémité 3' des molécules d’ARNm. La longueur de la queue poly(A) est étroitement régulée par les processus cellulaires. La dérégulation de la polyadénylation de l’ARNm a été associée à une expression génique anormale et à diverses maladies, notamment le cancer, les troubles neurologiques et les anomalies du développement. Par conséquent, la compréhension de la dynamique de la polyadénylation est essentielle pour démêler les complexités du traitement de l’ARNm et de la régulation post-transcriptionnelle des gènes.

Cet article présente une méthode de mesure de la longueur de la queue poly(A) dans des échantillons d’ARN isolés à partir de cerveaux larvaires de drosophile et de cellules S2 de Drosophila Schneider. Nous avons utilisé l’approche de guanosine/inosine (G/I), qui implique l’ajout enzymatique de résidus G/I à l’extrémité 3' de l’ARNm à l’aide de la poly(A) polymérase de levure. Cette modification protège l’extrémité 3' de l’ARN de la dégradation enzymatique. Les queues de poly(A) protégées sur toute la longueur sont ensuite transcrites à l’envers à l’aide d’une amorce antisens universelle. Par la suite, l’amplification par PCR est réalisée à l’aide d’un oligo spécifique au gène qui cible le gène d’intérêt, ainsi que d’un oligo de séquence universel utilisé pour la transcription inverse.

Cela génère des produits de PCR englobant les queues poly(A) du gène d’intérêt. Étant donné que la polyadénylation n’est pas une modification uniforme et qu’elle donne des queues de longueurs variables, les produits PCR présentent une gamme de tailles, ce qui conduit à un motif de frottis sur le gel d’agarose. Enfin, les produits PCR sont soumis à une électrophorèse sur gel capillaire à haute résolution, suivie d’une quantification à l’aide des tailles des produits de PCR poly(A) et du produit PCR spécifique au gène. Cette technique offre un outil simple et fiable pour analyser les longueurs de queue poly(A), ce qui nous permet de mieux comprendre les mécanismes complexes régissant la régulation de l’ARNm.

Introduction

La plupart des ARNm eucaryotes sont polyadénylés post-transcriptionnel à leur extrémité 3′ dans le noyau par l’ajout d’adénosines non matricielles par des poly(A) polymérases canoniques. Une queue poly(A) intacte est essentielle tout au long du cycle de vie de l’ARNm, car elle est essentielle à l’exportation nucléaire de l’ARNm¹, facilite l’interaction avec les protéines de liaison poly(A) pour améliorer l’efficacité de la traduction² et confère une résistance à la dégradation³. Dans certains cas, la queue poly(A) peut également subir une extension dans le cytoplasme, facilitée par des poly(A) pol....

Protocole

1. Élevage et sélection des larves de drosophile

1. Maintenir/cultiver la souche de mouche (w¹¹¹⁸, type sauvage) sur un milieu alimentaire standard à 25 °C dans un incubateur humidifié.
2. Sélectionnez 10 larves errantes du 3^e stade 72 h après la ponte.
3. Placez les larves dans une boîte de Pétri vide de 35 mm et lavez-les délicatement en transférant les larves dans la nouvelle boîte contenant l’eau du robinet à l’aide d’une pince. Faites-le 2 fois pour enlever toute nourriture restante.

2. Isolement du cerveau des

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons la technique de dissection du cerveau larvaire de la drosophile au stade du 3e stade errant ainsi que la préparation de l’échantillon à partir de cellules S2 de la drosophile. En raison de la nature labile des ARNm, le prélèvement d’échantillons nécessite une prudence accrue. Pour la dissection cérébrale larvaire, les cerveaux ne doivent pas être endommagés pendant l’isolement et ne doivent pas être maintenus en solution pendant une durée .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49