果 蝇 幼虫脑和细胞系的Poly A尾长测量

摘要

该协议描述了一种有效且可靠的方法，用于量化 果蝇 神经系统中目的基因的poly（A）长度，该方法可以很容易地适应来自其他物种的组织或细胞类型。

摘要

聚腺苷酸化是一种重要的转录后修饰，可将 poly（A） 尾部添加到 mRNA 分子的 3' 末端。poly（A）尾巴的长度受细胞过程的严格调节。mRNA 多聚腺苷酸化的失调与异常基因表达和各种疾病有关，包括癌症、神经系统疾病和发育异常。因此，了解多聚腺苷酸化的动力学对于揭示 mRNA 加工和转录后基因调控的复杂性至关重要。

本文介绍了一种测量从 果蝇 幼虫脑和 果蝇 施耐德 S2 细胞中分离的 RNA 样品中 poly（A） 尾长的方法。我们采用鸟苷/肌苷 （G/I） 拖尾方法，该方法涉及使用酵母聚 （A） 聚合酶在 mRNA 的 3' 末端酶促添加 G/I 残基。这种修饰可保护 RNA 的 3' 末端免受酶降解。然后使用通用反义引物对受保护的全长poly（A）尾部进行反转录。随后，使用靶向目标基因的基因特异性寡核苷酸以及用于逆转录的通用序列寡核苷酸进行PCR扩增。

这会产生包含目的基因的poly（A）尾部的PCR产物。由于聚腺苷酸化不是一种均匀的修饰，并且会导致不同长度的尾部，因此PCR产物显示出一系列尺寸，导致琼脂糖凝胶上的涂抹图案。最后，对PCR产物进行高分辨率毛细管凝胶电泳，然后使用poly（A）PCR产物和基因特异性PCR产物的大小进行定量。该技术为分析poly（A）尾长提供了一种简单可靠的工具，使我们能够更深入地了解控制mRNA调控的复杂机制。

引言

大多数真核 mRNA 通过经典 poly（A） 聚合酶添加非模板化腺苷，在细胞核的 3' 末端进行转录后多聚腺苷化。完整的 poly（A） 尾在 mRNA 的整个生命周期中至关重要，因为它对 mRNA 核输出至关重要¹，促进与 poly（A） 结合蛋白的相互作用以提高翻译效率²，并赋予抗降解性³。在某些情况下，poly（A） 尾部也可以在细胞质中延伸，这是由非经典 poly（A） 聚合酶⁴ 促进的。在细胞质中，poly （A） 尾长动态变化并影响 mRNA 分子的寿命。已知许多聚合酶和脱烯酰化酶可调节尾长 ^5,6,7。例如，poly（A）尾巴的缩短与翻译抑制相关，而poly（A）尾巴的延长增强了翻译^8,9。

不断积累的基因组研究已经证明了poly（A）尾长在真核生物学各个方面的基本意义。这包括在生殖细胞发育、早期胚胎发育、学习和记忆的神经元突触可塑性以及炎症反应中的作用

研究方案

1. 饲养和选择果蝇幼虫

1. 在加湿培养箱中，在25°C的标准苍蝇食品培养基上维持/培养苍蝇菌株（w¹¹¹⁸，野生型）。
2. 选10只游荡的3龄幼虫产卵后72小时。
3. 将幼虫放入35毫米的空培养皿中，并使用镊子将幼虫转移到装有自来水的新培养皿中，轻轻清洗它们。执行此操作 2 次以去除任何剩余的食物。

2.从果蝇幼虫的大脑分离（图1）

图1：3龄游荡期果蝇幼虫脑的解剖。....

结果

在这里，我们分析了果蝇幼虫大脑中 Dscam1 和 GAPDH 的 poly（A） 尾长（图 4）。分离的RNA在琼脂糖凝胶上可视化，用于质量控制。大约 600 个核苷酸大小的单个 RNA 条带表示完整的 RNA 制备（图 2A）。使用 Agilent 2100 生物分析仪对 RNA 进行 G/I 拖尾和高分辨率毛细管电泳。使用 Agilent 2100 Expert 软件导出凝胶图像并进行相应组装。来自GAP.......

讨论

在该方案中，我们描述了从徘徊的3龄阶段解剖果蝇幼虫大脑的技术以及果蝇S2细胞的样品制备。由于 mRNA 的不稳定性，样本采集需要格外小心。对于幼虫脑夹层，大脑在隔离期间不应受损，也不应长时间保存在溶液中。将解剖时间保持在 8-10 分钟进行一轮解剖是必不可少的。用RNA酶抑制剂补充解剖液也可能是有益的。至于 S2 细胞培养和转染，请在层流罩中执行所有步骤。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49