Medición de la longitud de la cola de Poly A a partir del cerebro y la línea celular de la larva de Drosophila

Resumen

El protocolo describe un método eficiente y fiable para cuantificar la longitud poli(A) del gen de interés del sistema nervioso de Drosophila , que puede adaptarse fácilmente a tejidos o tipos celulares de otras especies.

Resumen

La poliadenilación es una modificación postranscripcional crucial que agrega colas de poli(A) al extremo 3' de las moléculas de ARNm. La longitud de la cola de poli(A) está estrechamente regulada por procesos celulares. La desregulación de la poliadenilación del ARNm se ha asociado con una expresión génica anormal y diversas enfermedades, como el cáncer, los trastornos neurológicos y las anomalías del desarrollo. Por lo tanto, comprender la dinámica de la poliadenilación es vital para desentrañar las complejidades del procesamiento del ARNm y la regulación génica postranscripcional.

Este artículo presenta un método para medir la longitud de la cola de poli(A) en muestras de ARN aisladas de cerebros de larvas de Drosophila y células S2 de Drosophila Schneider. Empleamos el enfoque de relavesa guanosina/inosina (G/I), que implica la adición enzimática de residuos G/I en el extremo 3' del ARNm utilizando poli(A) polimerasa de levadura. Esta modificación protege el extremo 3' del ARN de la degradación enzimática. A continuación, las colas de polietileno (A) protegidas se transcriben a la inversa utilizando un cebador antisentido universal. Posteriormente, la amplificación por PCR se realiza utilizando un oligonucleótido específico del gen que se dirige al gen de interés, junto con un oligonucleótido de secuencia universal utilizado para la transcripción inversa.

Esto genera productos de PCR que abarcan las colas de poli(A) del gen de interés. Dado que la poliadenilación no es una modificación uniforme y da lugar a colas de diferentes longitudes, los productos de PCR muestran una gama de tamaños, lo que da lugar a un patrón de frotis en el gel de agarosa. Por último, los productos de PCR se someten a electroforesis en gel capilar de alta resolución, seguida de la cuantificación utilizando los tamaños de los productos de PCR poli(A) y el producto de PCR específico del gen. Esta técnica ofrece una herramienta sencilla y fiable para analizar las longitudes de la cola de poli(A), lo que nos permite obtener una visión más profunda de los intrincados mecanismos que gobiernan la regulación del ARNm.

Introducción

La mayoría de los ARNm eucariotas están poliadenilados postranscripcionalmente en su extremo 3' en el núcleo mediante la adición de adenosinas no moldeadas por poli(A) polimerasas canónicas. Una cola de poli(A) intacta es fundamental a lo largo del ciclo de vida del ARNm, ya que es esencial para la exportación nuclear de ARNm¹, facilita la interacción con las proteínas de unión a poli(A) para mejorar la eficiencia de la traducción² e imparte resistencia contra la degradación³. En ciertos casos, la cola de poli(A) también puede sufrir una extensión en el citoplasma, facilitada por poli(A) polimeras....

Protocolo

1. Cría y selección de larvas de Drosophila

1. Mantener/cultivar la cepa de mosca (w¹¹¹⁸, wildtype) en un medio estándar de alimentación para moscas a 25 °C en una incubadora humidificada.
2. Seleccione 10 larvas errantes de 3er estadio 72 h después de la puesta de huevos.
3. Coloque las larvas en una placa de Petri vacía de 35 mm y lávelas suavemente transfiriendo las larvas a la nueva placa que contiene agua del grifo con fórceps. Haga esto 2 veces para eliminar cualquier resto de comida.

2. Aislamiento cerebral de

Discusión

En este protocolo, describimos la técnica para diseccionar el cerebro de la larva de Drosophila de la etapa errante del^3er estadio, así como la preparación de la muestra de células de Drosophila S2. Debido a la naturaleza lábil de los ARNm, la recolección de muestras requiere precaución adicional. Para la disección del cerebro de las larvas, los cerebros no deben dañarse durante el aislamiento y no deben mantenerse en solución durante un período prolongado. Es esencial mantener el .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49