Messung der Poly-A-Schwanzlänge aus Drosophila-Larvengehirn und Zelllinien

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine effiziente und zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Poly(A)-Länge des interessierenden Gens aus dem Drosophila-Nervensystem , die leicht an Gewebe oder Zelltypen anderer Spezies angepasst werden kann.

Zusammenfassung

Die Polyadenylierung ist eine entscheidende posttranskriptionelle Modifikation, bei der Poly(A)-Schwänze an das 3'-Ende von mRNA-Molekülen angehängt werden. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes wird durch zelluläre Prozesse streng reguliert. Eine Dysregulation der mRNA-Polyadenylierung wurde mit abnormaler Genexpression und verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Krebs, neurologische Störungen und Entwicklungsstörungen. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Polyadenylierung von entscheidender Bedeutung, um die Komplexität der mRNA-Prozessierung und der posttranskriptionellen Genregulation zu entschlüsseln.

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Poly(A)-Schwanzlängen in RNA-Proben vorgestellt, die aus Drosophila-Larvengehirnen und Drosophila-Schneider-S2-Zellen isoliert wurden. Wir verwendeten den Guanosin/Inosin (G/I)-Tailing-Ansatz, bei dem G/I-Reste enzymatisch am 3'-Ende der mRNA unter Verwendung von Hefe-Poly(A)-Polymerase hinzugefügt werden. Diese Modifikation schützt das 3'-Ende der RNA vor enzymatischem Abbau. Die geschützten Poly(A)-Schwänze in voller Länge werden dann mit einem universellen Antisense-Primer rückwärts transkribiert. Anschließend wird die PCR-Amplifikation mit einem genspezifischen Oligo durchgeführt, das auf das interessierende Gen abzielt, zusammen mit einem universellen Sequenzoligo, das für die reverse Transkription verwendet wird.

Dadurch werden PCR-Produkte erzeugt, die die Poly(A)-Schwänze des interessierenden Gens umfassen. Da die Polyadenylierung keine einheitliche Modifikation ist und zu unterschiedlich langen Schwänzen führt, weisen die PCR-Produkte eine Reihe von Größen auf, was zu einem Abstrichmuster auf Agarosegel führt. Abschließend werden die PCR-Produkte einer hochauflösenden Kapillargelelektrophorese unterzogen, gefolgt von einer Quantifizierung anhand der Größen der Poly(A)-PCR-Produkte und des genspezifischen PCR-Produkts. Diese Technik bietet ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug zur Analyse von Poly(A)-Schwanzlängen, das es uns ermöglicht, tiefere Einblicke in die komplizierten Mechanismen der mRNA-Regulation zu gewinnen.

Einleitung

Die meisten eukaryotischen mRNAs werden an ihrem 3′-Terminus im Zellkern durch Zugabe von nicht-template-Adenosinen durch kanonische Poly(A)-Polymerasen posttranskriptionell polyadenyliert. Ein intakter Poly(A)-Schwanz ist während des gesamten Lebenszyklus von mRNA von entscheidender Bedeutung, da er für den mRNA-Kernexport^{unerlässlich ist 1}, die Interaktion mit Poly(A)-bindenden Proteinen erleichtert, um die Translationseffizienz zu verbessern², und Resistenz gegen Abbau^{verleiht 3}. In bestimmten Fällen kann der Poly(A)-Schwanz auch im Zytoplasma gedehnt werden, was durch nicht-kanonische Poly(A)-....

Protokoll

1. Aufzucht und Selektion von Drosophila-Larven

1. Den Fliegenstamm (w¹¹¹⁸, Wildtyp) auf Standard-Fliegenfuttermedium bei 25 °C in einem befeuchteten Inkubator pflegen/kultivieren.
2. Wählen Sie 10 wandernde Larven des 3^. Stadiums 72 h nach der Eiablage aus.
3. Legen Sie die Larven in eine leere 35-mm-Petrischale und waschen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Larven mit einer Pinzette in die neue Schale mit Leitungswasser geben. Tun Sie dies 2x, um restliche Lebensmittel zu entfernen.

2. Isolierung des Gehirns von

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik zur Sezierung des Drosophila-Larvengehirns aus dem wandernden 3^. Stadium sowie die Probenvorbereitung aus Drosophila S2-Zellen. Aufgrund der labilen Natur von mRNAs erfordert die Probenentnahme besondere Vorsicht. Bei der Larvendissektion des Gehirns sollte das Gehirn während der Isolation nicht beschädigt und nicht über einen längeren Zeitraum in Lösung gehalten werden. Es ist wichtig, die Sezierzeit für eine Sezierrunde auf 8-10 Minuten .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49