מדידת אורך זנב Poly A מזחלי דרוזופילה מוח וקו תאים

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה יעילה ואמינה לכימות אורך הפולי(A) של הגן המעניין ממערכת העצבים דרוזופילה , שניתן להתאים בקלות לרקמות או סוגי תאים ממינים אחרים.

Abstract

פוליאדנילציה היא שינוי חיוני לאחר שעתוק המוסיף זנבות פולי(A) לקצה 3' של מולקולות mRNA. אורך זנב הפולי(A) מווסת היטב על ידי תהליכים תאיים. דיסרגולציה של פוליאדנילציה mRNA נקשרה לביטוי גנים חריג ולמחלות שונות, כולל סרטן, הפרעות נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות. לכן, הבנת הדינמיקה של פוליאדנילציה חיונית לפענוח המורכבות של עיבוד mRNA ובקרת גנים לאחר שעתוק.

מאמר זה מציג שיטה למדידת אורכי זנב פולי(A) בדגימות RNA שבודדו ממוחות זחלי דרוזופילה ומתאי דרוזופילה שניידר S2. השתמשנו בגישת הזנב גואנוזין/אינוזין (G/I), הכוללת הוספה אנזימטית של שאריות G/I בקצה ה-3' של mRNA באמצעות פולימראז שמרים (A). שינוי זה מגן על קצה ה-3' של הרנ"א מפני התפרקות אנזימטית. זנבות הפולי(A) המוגנים באורך מלא מתועתקים לאחור באמצעות פריימר אנטיסנס אוניברסלי. לאחר מכן, הגברה PCR מבוצעת באמצעות אוליגו ספציפי לגן המכוון לגן המעניין, יחד עם אוליגו רצף אוניברסלי המשמש לשעתוק לאחור.

זה מייצר תוצרי PCR המקיפים את זנבות הפולי(A) של הגן המעניין. מכיוון שפוליאדנילציה אינה שינוי אחיד וגורמת לזנבות באורכים משתנים, מוצרי ה-PCR מציגים מגוון גדלים, מה שמוביל לדפוס מריחה על ג'ל אגרוז. לבסוף, מוצרי ה- PCR נתונים לאלקטרופורזה של ג'ל נימי ברזולוציה גבוהה, ואחריה כימות באמצעות הגדלים של מוצרי ה- PCR poly(A) ומוצר ה- PCR הספציפי לגן. טכניקה זו מציעה כלי פשוט ואמין לניתוח אורכי זנב פולי(A), ומאפשרת לנו לקבל תובנות עמוקות יותר על המנגנונים המורכבים השולטים בוויסות mRNA.

Introduction

רוב ה-mRNA האיקריוטי עובר פוליאדנילציה לאחר שעתוק בנקודת הסיום של 3′ בגרעין על ידי תוספת של אדנוזין ללא תבנית על ידי פולימראזות פולי(A) קנוניות. זנב פולי(A) שלם הוא חיוני לאורך מחזור החיים של mRNA, מכיוון שהוא חיוני לייצוא גרעיני של mRNA¹, מאפשר אינטראקציה עם חלבונים קושרי פולי(A) כדי לשפר את יעילות התרגום², ומקנה עמידות בפני פירוק³. במקרים מסוימים, זנב פולי(A) יכול גם לעבור הארכה בציטופלסמה, בסיוע פולימראז (A) לא קנוני⁴. בציטופלסמה, אורך הזנב של פולי (A) משתנה באופן דינמי ומשפיע על תוחלת החיים של מולקולת ה-mRNA. פולימרזות ודדנילזות רבות ידועות באפנון אורך הזנב

Protocol

1. גידול ובחירת זחלי דרוזופילה

1. תחזוק/תרבית את זן הזבוב (W¹¹¹⁸, wildtype) על מזון זבובים סטנדרטי בטמפרטורה של 25°C באינקובטור לח.
2. בחר 10 זחלי כוכב נודדים 3^rd 72 שעות לאחר הטלת ביצים.
3. מניחים את הזחלים בכלי פטרי ריק בקוטר 35 מ"מ ושוטפים אותם בעדינות על ידי העברת הזחלים לצלחת החדשה המכילה מי ברז באמצעות מלקחיים. בצעו פעולה זו פעמיים כדי להסיר את שאריות המזון.

2. בידוד מוחי מזחלי דרוזופילה (איור 1)

תוצאות

כאן ניתחנו את אורך הזנב של פולי(A) של Dscam1 ו-GAPDH ממוחות של זחלי דרוזופילה (איור 4). RNA מבודד הודגם על ג'ל אגרוז לבקרת איכות. רצועת רנ"א בודדת בגודל של כ-600 נוקלאוטידים מצביעה על הכנת רנ"א שלמה (איור 2A). RNAs היו נתונים לזנב G/I ולאלקטרופורזה נימית ברזולוצי.......

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הטכניקה לנתח את מוח הזחל Drosophila משלב 3rd^instar נודד, כמו גם את הכנת הדגימה מתאי Drosophila S2. בשל אופיים העלוב של mRNAs, איסוף הדגימות דורש זהירות יתרה. במקרה של דיסקציה מוחית של הזחל, המוח לא אמור להיפגע במהלך הבידוד ואין לשמור אותו בתמיסה למשך זמן ממושך. שמירה .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49