Drosophila Larva Beyin ve Hücre Hattından Poli A Kuyruk Uzunluğunun Ölçülmesi

Özet

Protokol, diğer türlerden dokulara veya hücre tiplerine kolayca uyarlanabilen, Drosophila sinir sisteminden ilgilenilen genin poli(A) uzunluğunu ölçmek için verimli ve güvenilir bir yöntemi açıklar.

Özet

Poliadenilasyon, mRNA moleküllerinin 3' ucuna poli(A) kuyrukları ekleyen çok önemli bir transkripsiyon sonrası modifikasyondur. Poli(A) kuyruğunun uzunluğu, hücresel süreçler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. mRNA poliadenilasyonunun düzensizliği, anormal gen ekspresyonu ve kanser, nörolojik bozukluklar ve gelişimsel anormallikler dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, poliadenilasyonun dinamiklerini anlamak, mRNA işleme ve transkripsiyon sonrası gen regülasyonunun karmaşıklıklarını çözmek için hayati önem taşır.

Bu makale, Drosophila larva beyinlerinden ve Drosophila Schneider S2 hücrelerinden izole edilen RNA örneklerinde poli(A) kuyruk uzunluklarını ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Maya poli(A) polimeraz kullanılarak mRNA'nın 3' ucuna G/I kalıntılarının enzimatik eklenmesini içeren guanozin/inosin (G/I) kuyruk yaklaşımını kullandık. Bu modifikasyon, RNA'nın 3' ucunu enzimatik bozulmadan korur. Korunan tam uzunluktaki poli(A) kuyruklar daha sonra evrensel bir antisens astar kullanılarak ters kopyalanır. Daha sonra, PCR amplifikasyonu, ters transkripsiyon için kullanılan evrensel bir dizi oligo ile birlikte ilgilenilen geni hedefleyen gene özgü bir oligo kullanılarak gerçekleştirilir.

Bu, ilgilenilen genin poli(A) kuyruklarını kapsayan PCR ürünleri üretir. Poliadenilasyon tek tip bir modifikasyon olmadığından ve farklı uzunluklarda kuyruklarla sonuçlandığından, PCR ürünleri bir dizi boyut gösterir ve bu da agaroz jel üzerinde bir leke desenine yol açar. Son olarak, PCR ürünleri yüksek çözünürlüklü kapiler jel elektroforezine tabi tutulur, ardından poli(A) PCR ürünlerinin ve gene özgü PCR ürününün boyutları kullanılarak miktar tayini yapılır. Bu teknik, poli(A) kuyruk uzunluklarını analiz etmek için basit ve güvenilir bir araç sunarak, mRNA regülasyonunu yöneten karmaşık mekanizmalar hakkında daha derin bilgiler edinmemizi sağlar.

Giriş

Çoğu ökaryotik mRNA, kanonik poli(A) polimerazlar tarafından şablonlanmamış adenosinlerin eklenmesiyle çekirdekteki 3' terminallerinde transkripsiyon sonrası poliadenillenir. Bozulmamış bir poli(A) kuyruğu, mRNA'nın yaşam döngüsü boyunca çok önemlidir, çünkü mRNA nükleer ihracatı¹ için gereklidir, translasyon verimliliğini^artırmak için poli(A) bağlayıcı proteinlerle etkileşimi kolaylaştırır 2 ve bozunmaya^{karşı direnç kazandırır 3}. Bazı durumlarda, poli(A) kuyruğu, kanonik olmayan poli(A) polimerazlar⁴ tarafından kolaylaştırılan sitoplazmada da uzamaya uğrayabilir. Sitoplazm....

Protokol

1. Drosophila larvalarının yetiştirilmesi ve seçilmesi

1. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 ° C'de standart sinek yemi ortamında sinek suşunu (w¹¹¹⁸, vahşi tip) koruyun / kültürleyin.
2. Yumurtlamadan 72 saat sonra 10 dolaşan 3^. instar larvasını seçin.
3. Larvaları 35 mm'lik boş bir Petri kabına koyun ve larvaları forseps kullanarak musluk suyu içeren yeni kaba aktararak nazikçe yıkayın. Kalan yiyecekleri çıkarmak için bunu 2 kez yapın.

2. Drosophila larvalarından beyin izolasyonu

Tartışmalar

Bu protokolde, Drosophila larva beynini dolaşan 3^{. instar} aşamasından diseksiyon tekniğini ve Drosophila S2 hücrelerinden örnek hazırlamayı açıklıyoruz. mRNA'ların kararsız doğası nedeniyle, numune toplama ekstra dikkat gerektirir. Larva beyin diseksiyonu için izolasyon sırasında beyinler zarar görmemeli ve uzun süre solüsyon içinde tutulmamalıdır. Bir diseksiyon turu için diseksiyon süresini 8-10 dakika olarak tutmak esastır. Diseksiyon solüsyonunun RNAaz inhibit?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49