Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد ثبت أن العديد من البروتينات المضطربة جوهريا تشارك في تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية الديناميكية للغاية ، وهو سلوك مهم للعديد من العمليات الخلوية. هنا ، نقدم طريقة قائمة على التصوير أحادي الجزيء لتحديد الديناميات التي تتفاعل بها البروتينات مع بعضها البعض في المكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا الحية.

Abstract

تعتبر المكثفات الجزيئية الحيوية المتكونة عن طريق فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) حاسمة في التنظيم الخلوي وعدد متزايد من الوظائف الخلوية. يعد توصيف LLPS في الخلايا الحية أمرا مهما أيضا لأن التكثيف الشاذ مرتبط بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطانات والاضطرابات التنكسية العصبية. غالبا ما يكون LLPS مدفوعا بالتفاعلات الانتقائية والعابرة والمتعددة التكافؤ بين البروتينات المضطربة جوهريا. من الأمور ذات الأهمية الكبيرة ديناميات تفاعل البروتينات المشاركة في LLPS ، والتي يتم تلخيصها جيدا من خلال قياسات وقت إقامتها المرتبط (RT) ، أي مقدار الوقت الذي تقضيه داخل المكثفات. هنا ، نقدم طريقة تعتمد على تصوير الخلية الحية أحادية الجزيء تسمح لنا بقياس متوسط RT لبروتين معين داخل المكثفات. نحن نتصور في وقت واحد جزيئات البروتين الفردية والمكثفات التي ترتبط بها ، ونستخدم تتبع الجسيمات المفردة (SPT) لرسم مسارات أحادية الجزيء ، ثم نلائم المسارات مع نموذج ارتباط قطرات البروتين لاستخراج متوسط RT للبروتين. أخيرا ، نعرض نتائج تمثيلية حيث تم تطبيق طريقة التصوير أحادية الجزيء هذه لمقارنة متوسط RTs للبروتين في مكثفات LLPS عند دمجها وعدم دمجها في مجال oligomerizing. ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع لقياس ديناميكيات التفاعل لأي بروتين يشارك في LLPS.

Introduction

تشير مجموعة متزايدة من الأعمال إلى أن المكثفات الجزيئية الحيوية تلعب دورا مهما في التنظيم الخلوي والعديد من الوظائف الخلوية ، على سبيل المثال ، تنظيم النسخ1،2،3،4،5 ، إصلاح تلف الحمض النووي6،7،8 ، تنظيم الكروماتين9،10،11،12 ، كروموسوم X تعطيل13،14،15 ، والإشارات داخل الخلايا16،17،18. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم تنظيم المكثفات الجزيئية الحيوية متورط في العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطانات19،20،21 والاضطرابات التنكسية العصبية22،23،24،25،26. غالبا ما يكون تكوين المكثفات مدفوعا ببروتين بروتين عابر وانتقائي ومتعدد التكافؤ أو حمض نووي بروتيني أو تفاعلات حمض نووي - حمض نووي27. في ظل ظروف معينة ، يمكن أن تؤدي هذه التفاعلات إلى فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) ، وهو انتقال الكثافة الذي يثري محليا جزيئات حيوية محددة في قطرات خالية من الغشاء. غالبا ما يتم التوسط في مثل هذه التفاعلات متعددة التكافؤ من خلال المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) للبروتينات1،28،29. يعد التوصيف الفيزيائي الحيوي لهذه التفاعلات على المستوى الجزيئي أمرا بالغ الأهمية لفهمنا للعديد من الوظائف الخلوية الصحية والشاذة ، نظرا لانتشار المكثفات عبرها. على الرغم من أن التقنيات القائمة على الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر ، على سبيل المثال ، استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) 30،31،32 ، قد استخدمت على نطاق واسع لإظهار نوعيا أن التبادلات الجزيئية بين المكثفات والبيئة الخلوية المحيطة ديناميكية ، فإن تحديد ديناميكيات التفاعل لجزيئات حيوية محددة داخل المكثفات غير ممكن بشكل عام باستخدام المجهر التقليدي متحد البؤر أو جزيء واحد الفحص المجهري بدون طرق تحليل البيانات المتخصصة. تعتمد تقنية تتبع الجسيمات المفردة (SPT) الموصوفة في هذا البروتوكول على المجهر أحادي الجزيء33 للخلية الحية وتوفر أداة قوية بشكل فريد لتحديد ديناميكيات التفاعل بين بروتينات معينة داخل المكثفات. قراءة SPT لمثل هذا القياس هي متوسط وقت بقاء البروتين المهم في المكثفات.

يمكن تقسيم البروتوكول إلى قسمين - الحصول على البيانات وتحليل البيانات. تتمثل الخطوة الأولى في الحصول على بيانات التصوير في التعبير في الخلايا عن بروتين مهم يتم دمجه في HaloTag34. يتيح ذلك وضع علامات على البروتين محل الاهتمام باثنين من الفلوروفورات ، حيث يتم تمييز غالبية جزيئات البروتين بفلوروفور غير قابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، JFX549 Halo ligand35) ويتم تمييز جزء صغير منها بفلوروفور متميز طيفيا وقابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، PA-JF646 Halo ligand36). وهذا يسمح بالاستحواذ المتزامن على جميع مواقع المكثفات في الخلية والحصول على أفلام أحادية الجزيء من البروتين المرتبط وغير المرتبط بالمكثفات. وفي الوقت نفسه ، يتم تعديل نفس النوع من الخلايا للتعبير بثبات عن H2B الموسوم بالهالة ، وهو حجر غير متحرك إلى حد كبير على الكروماتين. ثم يتم تلطيخ الخلايا ب PA-JF646 Halo ligand لتمكين التصوير أحادي الجزيء ل H2B. كما سيتم مناقشته بالتفصيل أدناه ، فإن هذه التجربة تفسر مساهمة التبييض الضوئي لتمكين التحديد الكمي الدقيق لديناميكيات التفاعل للبروتين محل الاهتمام. يجب بعد ذلك زراعة الخلايا المستخدمة في تجارب التصوير على أغطية نظيفة ، وملطخة ب HaloTag ligand (s) ، وتجميعها في غرفة تصوير الخلايا الحية. من هناك ، يتم تصوير العينة تحت إضاءة ورقة بصرية مائلة للغاية ومصفحة (HILO) على مجهر مضان انعكاس داخلي كلي (TIRF) قادر على التصوير ثنائي القناة واكتشاف جزيء واحد. ثم يتم تقسيم الانبعاث إلى كاميرتين ، واحدة تتبع مواقع المكثفات والأخرى تتبع جزيئات واحدة. يتم إجراء الاكتساب مع وقت تكامل طويل (بترتيب مئات مللي ثانية) لطمس البروتينات المنتشرة بحرية والتقاط البروتينات الأقل قدرة على الحركة فقط بسبب الارتباط بالهياكل المستقرة في الخلية37.

تتمثل الخطوة الأولى في تحليل البيانات في استخدام خوارزمية تتبع الجسيمات المفردة (SPT)38,39 لتوطين جزيئات البروتين الفردية في كل إطار من الفيلم وتجميع عمليات التوطين في مسار لكل جزيء على مدار عمره القابل للاكتشاف. ثم يتم فرز المسارات إلى تلك التي تمثل الجزيئات الموجودة بالداخل وتلك التي تمثل الجزيئات خارج المكثفات من خلال مقارنة توطين الجزيئات عبر مساراتها بتوطين جميع المكثفات في الأوقات المقابلة1.

بعد ذلك ، يتم إنشاء منحنى البقاء (1 - CDF) باستخدام أطوال جميع مسارات المكثفات. ثم يتم استخراج متوسط وقت الإقامة الظاهري للجزيئات عن طريق ملاءمة منحنى البقاء على النموذج الأسي المكون من عنصرين التالي لارتباط البروتين ،

figure-introduction-5276,

مع A كجزء من الجزيئات غير المرتبطة على وجه التحديد ومع kobs و ns و kobs و s كمعدلات تفكك ملحوظة للجزيئات غير المرتبطة على وجه التحديد والجزيئات المرتبطة على وجه التحديد ، على التوالي. فقط kobs ، s يعتبر من هنا فصاعدا. تساهم ديناميكيات كل من تفكك البروتين ، ktrue ، s ، والتبييض الضوئي للفلوروفور ، kpb ، في kobs ، s ك

figure-introduction-5875;

وبالتالي ، لعزل آثار تفكك البروتين ، يتم قياس معدل التفكك المحدد ل H2B-Halo في خط الخلية المذكور سابقا.

figure-introduction-6125

H2B هو بروتين مدمج بثبات في الكروماتين ويعاني من الحد الأدنى من التفكك في النطاق الزمني لاكتساب فيلم أحاديالجزيء 37. ثم يكون معدل تفككه المحدد مساويا لمعدل التبييض الضوئي ل PA-JF646 Halo ligand ، أو

figure-introduction-6493.

متوسط وقت الإقامة في المكثف للبروتين محل الاهتمام ، figure-introduction-6663هو إذن

figure-introduction-6786.

يتم عرض النتائج التمثيلية من Irgen-Gioro et al.40 ، حيث تم تطبيق هذا البروتوكول لإثبات أن دمج مجال oligomerization إلى IDR يؤدي إلى أوقات إقامة أطول ل IDR في مكثفاته. تشير هذه النتيجة إلى أن مجال oligomerization المضاف يعمل على استقرار التفاعلات المتجانسة ل IDR التي تحرك LLPS. من حيث المبدأ ، يمكن تطبيق نفس الطريقة مع البروتوكولات المعدلة قليلا لتوصيف التفاعلات المتجانسة أو غير المتجانسة لأي بروتين يشارك في تكوين أي نوع من المكثفات.

Protocol

1. وضع العلامات على البروتينات في الخلايا

  1. عبر عن البروتين محل الاهتمام المنصهر في HaloTag في خط الخلية المطلوب.
  2. يعبر بثبات عن H2B الموسوم بالهالة في نفس النوع من الخلايا كما في 1.1 باستخدام الترانسبوزونات أو النقل الفيروسي.

2. إعداد أغطية

  1. قبل استخدام أغطية الأغطية لزراعة الخلايا ، قم بتنظيف أغطية الأغطية لإزالة الملوثات الفلورية الذاتية.
    1. قم بتركيب غطاء بقطر 25 مم ، # 1.5 على رف تلطيخ من السيراميك وضعه في وعاء من مادة البولي بروبيلين.
    2. اغمر أغطية الغطاء تماما في محلول 1 متر من KOH و sonicate لمدة 1 ساعة.
    3. شطف أغطية الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج (ddH2O).
    4. اغمر تماما أغطية الإيثانول بنسبة 100٪ وصوتنة لمدة 1 ساعة.
    5. اغمر أغطية الغطاء تماما في 20٪ من الإيثانول المخفف ب ddH2O وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

3. تحضير الخلايا للفحص المجهري

ملاحظة: قم بتنفيذ خطوات من هذا القسم في خزانة السلامة الحيوية لمنع تلوث الخلايا.

  1. خلايا لوحة على أغطية نظيفة. أداء 2 أيام قبل التصوير إذا كان سيتم التعبير عن البروتين الموسومة Halo بشكل عابر. أداء 1 يوم قبل التصوير إذا تم التعبير عن البروتين الموسومة Halo بثبات أو داخليا.
    1. استخدم ملقط معقم لوضع أغطية في لوحة ذات 6 آبار (غطاء واحد / بئر لكل عينة خلية) والسماح للإيثانول المتبقي بالتبخر.
    2. لوحة كل بئر مع عدد مناسب من الخلايا لتحقيق التقاء 70 ٪ بحلول وقت التصوير. لوحة بئر إضافية مع خلايا تعبر بثبات عن H2B-Halo مع نفس التقاء الهدف.
    3. اتبع هذه الخطوة فقط إذا كنت تعبر بشكل عابر عن البروتين الموسوم بالهالة محل الاهتمام. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا باستخدام البلازميد الذي يشفر البروتين الموسوم محل الاهتمام باستخدام كواشف النقل المناسبة واتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    4. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. قم بتلطيخ الخلايا التي تعبر عن البروتين الموسوم بالهالة محل الاهتمام بكل من ليجند هالو غير قابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، JFX549) وليجند هالة قابل للتنشيط الضوئي (على سبيل المثال ، PA-JF646). خلايا البقع التي تعبر عن H2B-Halo مع ليجند Halo القابل للتنشيط الضوئي فقط.
    ملاحظة: يجب استخدام تركيزات روابط الهالة المدرجة هنا كنقطة انطلاق. يعتمد التركيز الأمثل على مستوى التعبير والتركيز المحلي المكثف للبروتين محل الاهتمام.
    1. لكل عينة خلية تعبر عن البروتين الموسوم بالهالة محل الاهتمام ، قم بتخفيف 100 نانومتر JFX549 Halo ligand35 و 20 nM PA-JF646 Haloligand 36 في 500 ميكرولتر من وسائط الخلية المناسبة. لكل عينة تعبر عن H2B-Halo ، قم بتخفيف 20 نانومتر فقط PA-JF646 Halo ligand في 500 ميكرولتر من وسائط الخلية المناسبة.
    2. لكل بئر ، قم باستنشاق الوسائط الموجودة ، وأضف 2 مل من 1x PBS ، ثم استنشاق PBS (يشار إلى هذا باسم "شطف" لبقية البروتوكول) ، واستبدله بالوسائط التي تحتوي على روابط Halo المناسبة.
    3. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. شطف مع برنامج تلفزيوني أربع مرات واستبدالها بوسائط جديدة لا تحتوي على روابط هالة.
    5. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    6. كرر الخطوتين 3.2.4 و 3.2.5 ثلاث مرات (إجمالي أربع دورات شطف وحضانة).
    7. استخدم ملقط معقم لنقل غطاء الغطاء مع الخلايا إلى غرفة غطاء زراعة الخلايا المتوافقة مع مرحلة المجهر.
    8. أضف وسائط خالية من الفينول الأحمر إلى الغرفة وانتقل إلى التصوير. احتضان العينات التي لم يتم تصويرها على الفور عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى الحاجة.

4. التصوير أحادي الجزيء

ملاحظة: يجب إجراء تجارب مستقلة تقيس أوقات الإقامة لكل من H2B والبروتين محل الاهتمام عبر عدة أيام (≥3) لتوليد نتائج ذات دلالة إحصائية. قبل تصوير عينات الخلايا على المجهر ، قم بمحاذاة الكاميرتين باستخدام كريات مجهرية ملطخة 0.1 ميكرومتر (جدول المواد) أو معيار معايرة مماثل.

  1. تحضير المجهر.
    1. قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر الذي يتحكم في المجهر.
    2. قم بتشغيل مكونات حضانة الخلايا الحية (السخان وثاني أكسيد الكربون2) على المجهر واضبطه على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. اسمح للنظام بالتوازن.
    3. ضع قطرة من الزيت المناسب على هدف غمر زيت TIRF 100x على المجهر وقم بتحميل عينة الخلية على مرحلة المجهر.
  2. تحديد خلية لصورة.
    1. قم بتصوير عينة الخلية تحت إضاءة برايت فيلد واضبط موضع z حتى يتم التركيز على الخلايا.
    2. تحديد الخلية التي تظهر الخصائص المورفولوجية للخلايا السليمة.
    3. اقتصاص مجال الرؤية (FOV) بحيث يلتقط فقط نواة الخلية المستهدفة.
    4. استخدم إضاءة الليزر واضبط زاوية TIRF حتى يتم تحقيق إضاءة HILO41 مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى للجزيئات المفردة.
  3. صورة H2B-Halo في الخلايا الحية.
    ملاحظة: قوى الليزر المستخدمة في هذا القسم خاصة بهذه التجربة وتم تضمينها كمثال. يجب اختيار قوى الليزر المناسبة وفقا للمعايير المدرجة في المناقشة.
    1. قم بإعداد تكوين اكتساب على النحو التالي. اضبط وقت التعرض على 500 مللي ثانية. خلال كل تعرض 500 مللي ثانية ، قم بإثارة جزيئات PA-JF646 المسمى H2B-Halo بحزمة 9.1 ميجاوات و 640 نانومتر. خلال الوقت الميت بين الإطارات (158.01 μs على نظام التصوير المستخدم هنا) ، قم بتنشيط الجزيئات ضوئيا بحزمة 111 μW ، 405 نانومتر.
    2. التقط 2000 إطار باستمرار ضمن هذه الإعدادات. قم بزيادة قدرة الحزمة 405 نانومتر تدريجيا على مدار عملية الاستحواذ عندما يصبح عدد الجزيئات المنشطة ضوئيا غير كاف.
  4. تخيل البروتين الموسوم بالهالة الذي يهم الخلايا الحية.
    1. استخدم مرآة ثنائية اللون طويلة التمرير لتقسيم الأطوال الموجية للانبعاث بين كاميرتين ، واحدة للكشف عن PA-JF646 والأخرى لاكتشاف JFX549. استخدم مرشحات الانبعاثات المناسبة أمام الكاميرات.
    2. استخدم نفس تكوين الاستحواذ الموضح في 4.3.1 مع التعديل التالي. أضف قناة JFX549 إضافية لتتبع مواقع مكثفات البروتين الموسومة بالهالة بمرور الوقت. كل 10 ثوان ، احصل على إطار واحد (500 مللي ثانية ، 2.1 ميجاوات ، إثارة 561 نانومتر) في قناة JFX549 مع الحفاظ على اكتساب قناة PA-JF646. سيؤدي ذلك إلى حدوث نزيف في قناة PA-JF646 ، والتي سيتم الاهتمام بها في تحليل بيانات ما بعد الاستحواذ.
    3. التقط 2000 إطار باستمرار ضمن هذه الإعدادات. قم بزيادة قدرة الحزمة 405 نانومتر تدريجيا على مدار عملية الاستحواذ عندما يصبح عدد الجزيئات المنشطة ضوئيا غير كاف.

5. تحليل بيانات التصوير أحادية الجزيء

ملاحظة: المعلمات المستخدمة في القسم 5 خاصة بهذه التجربة ومضمنة كمثال. يجب اختيار المعلمات المناسبة وفقا للمعايير المدرجة في المناقشة.

  1. إعداد بيانات التصوير الخام للمعالجة.
    1. للحصول على بيانات البروتين محل الاهتمام ، قم بتحويل كل قناة من ملف بيانات التصوير الخام إلى ملف .tif مستقل باستخدام ImageJ أو برنامج معالجة صور مشابه. بالنسبة لبيانات H2B ، قم بتحويل القناة المفردة من ملف بيانات التصوير الخام إلى ملف .tif بنفس الطريقة.
      ملاحظة: اعتمادا على برنامج الاستحواذ المستخدم ، يمكن أن تكون هناك إطارات فارغة في فيلم المكثفات ، حيث يتم أخذ إطار واحد فقط لتتبع المكثفات كل 10 ثوان. يجب ملء الإطارات الفارغة بأحدث إطار مكثف (تقوم بعض برامج الاستحواذ بذلك تلقائيا). بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان هناك نزيف كبير من قناة المكثف (JFX549) إلى قناة الجزيء الواحد (PA-JF646) أثناء إطارات تتبع المكثفات هذه ، فيجب استبدال إطارات الجزيء الواحد المقابلة بأحدث إطار أحادي الجزيء.
    2. إذا كانت هناك أي إطارات تحتاج إلى استبدالها في أي من الفيلمين للأسباب المذكورة أعلاه ، فاستبدلها بأحدث إطار من هذا الفيلم عن طريق تعديل (إذا لزم الأمر) و pretracking_comb.txt تشغيل ماكرو ImageJ متوفر في Chong et al.1 ، واتباع المطالبات.
  2. قم بإنشاء مسارات أحادية الجسيمات باستخدام برنامج SPT ، على سبيل المثال ، SLIMfast39 ، وهو تطبيق واجهة المستخدم الرسومية لخوارزمية MTT38 المتوفرة في Teves et al.42.
    1. قم بتحميل الملف من 5.1.2 الذي يحتوي على الفيلم أحادي الجزيء في SLIMfast بالنقر فوق تحميل > Imagestack.
    2. اضبط المعلمات (معدل خطأ الترجمة: 10-6 ؛ حلقات الانكماش: 3) للتعريب بالنقر فوق ورقة > OPT: الترجمة.
    3. اضبط المعلمات (ذروة الانبعاث: 664 نانومتر ؛ وقت التأخر: 500 مللي ثانية) للاكتساب بالنقر فوق OPT > ورقة: اكتساب.
    4. تصور توطين جميع الجزيئات في إطار واحد للتأكد من أن المعلمات المختارة مناسبة (TEST LOC). إذا لم يكن ذلك مناسبا ، فقم بتعديل المعلمات في الخطوتين 5.2.2 و 5.2.3 وكرر هذه الخطوة.
    5. قم بإنشاء ملف يحتوي على توطين جميع الجزيئات في كل إطار (LOC ALL).
    6. قم بتحميل الملف من 5.2.5 في SLIMfast بالنقر فوق تحميل > بيانات الجسيمات > SLIMfast.
    7. اضبط المعلمات (الحد الأقصى لمعامل الانتشار المتوقع: 0.1 ميكرومتر2 / ثانية ؛ الحد الأقصى لعدد المنافسين: 5) لتوليد المسار بالنقر فوق OPT > ورقة: التتبع.
    8. قم بإنشاء ملف يحتوي على مسارات جميع الجزيئات (GEN TRAJ).
  3. قم بتصفية المسارات الأقصر من tmin ، 2.5 s ، باستخدام evalSPT39 ، المتاح في Drosopoulos et al.43 ، لحساب أخطاء التتبع التي تؤدي إلى مسارات قصيرة بشكل مصطنع.
    1. قم بتحميل الملف من 5.2.8 إلى evalSPT (+ ملف > من 5.2.8 > موافق).
    2. اضبط المعلمات (الحد الأدنى: 5 إطارات ؛ الحد الأقصى: الحد الأقصى لطول المسار للملف من 5.2.8) لتصفية المسارات الأقصر من 2.5 ثانية.
    3. قم بإنشاء ملف بجميع المسارات التي تمت تصفيتها (تصدير البيانات).
  4. اتبع هذه الخطوة لمسارات البروتين محل الاهتمام فقط. قم بفرز المسارات إلى تلك الموجودة في المكثفات وخارج المكثفات ، ثم استخرج متوسط وقت الإقامة داخل المكثفات.
    ملاحظة: جميع رموز هذا القسم متوفرة في Chong et al.1.
    1. قم بضبط جميع إطارات الفيلم التي تم الحصول عليها في قناة JFX549 لإنشاء فيلم بفاصل زمني مملوء بالقناع الثنائي المتطور زمنيا الذي يبرز مواقع المكثفات عن طريق تشغيل mask_v2.txt الماكرو والنواة والكتلة ImageJ واتباع المطالبات.
    2. إعادة تنسيق مسارات الجزيء الواحد المتولدة في 5.3.3. باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، ConvertASCII_SlowTracking_css3 m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات والمعلمات حسب الضرورة. (المعلمات: التعرض ، 0.5 ثانية ؛ الدقة ، 0.16 ميكرومتر / بكسل).
    3. قم بفرز المسارات بناء على جزء العمر الذي يقضيه جزيء معين في مكثف ، F ، باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، categorization_v4.m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات حسب الضرورة.
    4. تابع باستخدام مسارات المكثفات فقط.
  5. استخرج kobs و s و kpb واحسب متوسط وقت الإقامة المصحح ، figure-protocol-10801.
    1. استخرج kobs,s من مسارات البروتين المكثف محل الاهتمام باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، PLOT_ResidenceHist_css.m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات والمعلمات حسب الضرورة.
      (المعلمات: التعرض ، 0.5 ثانية ؛ ستارت فريم فورفيت ، 5 إطارات).
    2. استخرج kpb من مسارات H2B باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، PLOT_ResidenceHist_css.m ، وضبط أسماء الملفات والمسارات والمعلمات حسب الضرورة.
      (المعلمات: التعرض ، 0.5 ثانية ؛ ستارت فريم فورفيت ، 5 إطارات).
    3. احسب متوسط وقت الإقامة المصحح للبروتين محل الاهتمام المرتبط تحديدا بمكثفاته ، figure-protocol-11574على النحو التالي:
      figure-protocol-11683
      ملاحظة: يجب إجراء الضوابط للتحقق من أن أوقات التعرض المختلفة الطويلة بما يكفي لطمس الجسيمات المتحركة ، على سبيل المثال ، 300 مللي ثانية و 800 مللي ثانية ، لا تزال تؤدي إلى نفس متوسط وقت بقاء البروتين محل الاهتمام.

النتائج

هنا ، نقدم نتائج تمثيلية من Irgen-Gioro et al.40 ، حيث استخدمنا بروتوكول SPT هذا لمقارنة ديناميكيات التفاعل بين بروتينين في مكثفات LLPS المجمعة ذاتيا. يحتوي TAF15 (العامل المرتبط بالبروتين المرتبط بصندوق TATA) على IDR يمكن أن يخضع ل LLPS عند الإفراط في التعبير في الخلايا البشرية. افترضنا أن دمج TAF15...

Discussion

تم تصميم البروتوكول كما هو معروض هنا لأنظمة مثل تلك التي تم التحقيق فيها في Irgen-Gioro et al.40. اعتمادا على التطبيق ، يمكن تعديل بعض مكونات البروتوكول ، على سبيل المثال ، طريقة إنشاء خطوط الخلايا ذات العلامات الفلورية ، ونظام وضع العلامات الفلورية ، وأسلوب غطاء الغطاء المستخدم. يمكن ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل زمالة أبحاث الدراسات العليا لمؤسسة العلوم الوطنية بموجب المنحة رقم. DGE-1745301 (SY) ، جائزة Pew-Stewart Scholar (SC) ، جائزة Searle Scholar (SC) ، منحة أبحاث مؤسسة Shurl and Kay Curci (SC) ، منحة Merkin Innovation Seed Grant (SC) ، منحة Mallinckrodt للأبحاث (SC) ، و Margaret E. منحة صندوق البحوث الطبية المبكرة 2024 (SC). كما يتم دعم SC من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI بموجب الجائزة رقم P30CA016042.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

References

  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030 (2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379 (2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474 (2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049 (2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787 (2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -. T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776 (2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357 (2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903 (2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280 (2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329 (2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved