قياس جزيء واحد لديناميكيات تفاعل البروتين داخل المكثفات الجزيئية الحيوية

Summary

لقد ثبت أن العديد من البروتينات المضطربة جوهريا تشارك في تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية الديناميكية للغاية ، وهو سلوك مهم للعديد من العمليات الخلوية. هنا ، نقدم طريقة قائمة على التصوير أحادي الجزيء لتحديد الديناميات التي تتفاعل بها البروتينات مع بعضها البعض في المكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا الحية.

Abstract

تعتبر المكثفات الجزيئية الحيوية المتكونة عن طريق فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) حاسمة في التنظيم الخلوي وعدد متزايد من الوظائف الخلوية. يعد توصيف LLPS في الخلايا الحية أمرا مهما أيضا لأن التكثيف الشاذ مرتبط بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطانات والاضطرابات التنكسية العصبية. غالبا ما يكون LLPS مدفوعا بالتفاعلات الانتقائية والعابرة والمتعددة التكافؤ بين البروتينات المضطربة جوهريا. من الأمور ذات الأهمية الكبيرة ديناميات تفاعل البروتينات المشاركة في LLPS ، والتي يتم تلخيصها جيدا من خلال قياسات وقت إقامتها المرتبط (RT) ، أي مقدار الوقت الذي تقضيه داخل المكثفات. هنا ، نقدم طريقة تعتمد على تصوير الخلية الحية أحادية الجزيء تسمح لنا بقياس متوسط RT لبروتين معين داخل المكثفات. نحن نتصور في وقت واحد جزيئات البروتين الفردية والمكثفات التي ترتبط بها ، ونستخدم تتبع الجسيمات المفردة (SPT) لرسم مسارات أحادية الجزيء ، ثم نلائم المسارات مع نموذج ارتباط قطرات البروتين لاستخراج متوسط RT للبروتين. أخيرا ، نعرض نتائج تمثيلية حيث تم تطبيق طريقة التصوير أحادية الجزيء هذه لمقارنة متوسط RTs للبروتين في مكثفات LLPS عند دمجها وعدم دمجها في مجال oligomerizing. ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع لقياس ديناميكيات التفاعل لأي بروتين يشارك في LLPS.

Introduction

تشير مجموعة متزايدة من الأعمال إلى أن المكثفات الجزيئية الحيوية تلعب دورا مهما في التنظيم الخلوي والعديد من الوظائف الخلوية ، على سبيل المثال ، تنظيم النسخ^{1،2،3،4،5} ، إصلاح تلف الحمض النووي^6،7،8 ، تنظيم الكروماتين^{9،10،11،12} ، كروموسوم X تعطيل^13،

Protocol

1. وضع العلامات على البروتينات في الخلايا

1. عبر عن البروتين محل الاهتمام المنصهر في HaloTag في خط الخلية المطلوب.
2. يعبر بثبات عن H2B الموسوم بالهالة في نفس النوع من الخلايا كما في 1.1 باستخدام الترانسبوزونات أو النقل الفيروسي.

2. إعداد أغطية

1. قبل استخدام أغطية الأغطية لزراعة الخلايا ، قم بتنظيف أغطية الأغطية لإزالة الملوثات الفلورية الذاتية.
   1. قم بتركيب غطاء بقطر 25 مم ، # 1.5 على رف تلطيخ من السيراميك وضعه في وعاء من مادة البولي بروبيلين.
   2. اغمر أغطية الغطاء تماما في محلول 1 متر من KOH و sonicate لمدة 1 ساعة.
   3. شطف أغطية الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر....

النتائج

هنا ، نقدم نتائج تمثيلية من Irgen-Gioro et ^al.40 ، حيث استخدمنا بروتوكول SPT هذا لمقارنة ديناميكيات التفاعل بين بروتينين في مكثفات LLPS المجمعة ذاتيا. يحتوي TAF15 (العامل المرتبط بالبروتين المرتبط بصندوق TATA) على IDR يمكن أن يخضع ل LLPS عند الإفراط في التعبير في الخلايا البشرية. افترضنا أن دمج TAF15.......

Discussion

تم تصميم البروتوكول كما هو معروض هنا لأنظمة مثل تلك التي تم التحقيق فيها في Irgen-Gioro et ^al.40. اعتمادا على التطبيق ، يمكن تعديل بعض مكونات البروتوكول ، على سبيل المثال ، طريقة إنشاء خطوط الخلايا ذات العلامات الفلورية ، ونظام وضع العلامات الفلورية ، وأسلوب غطاء الغطاء المستخدم. يمكن .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips