Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Resumen

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Resumen

Los condensados biomoleculares formados a través de la separación de fases líquido-líquido (LLPS) se han considerado críticos en la organización celular y en un número creciente de funciones celulares. La caracterización de la LLPS en células vivas también es importante porque la condensación aberrante se ha relacionado con numerosas enfermedades, incluidos cánceres y trastornos neurodegenerativos. La LLPS a menudo es impulsada por interacciones selectivas, transitorias y multivalentes entre proteínas intrínsecamente desordenadas. De gran interés son las dinámicas de interacción de las proteínas que participan en LLPS, que se resumen bien mediante mediciones de su tiempo de residencia de unión (RT), es decir, la cantidad de tiempo que pasan unidas dentro de los condensados. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de células vivas de una sola molécula que nos permite medir el RT medio de una proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultáneamente las moléculas de proteína individuales y los condensados con los que se asocian, utilizamos el seguimiento de una sola partícula (SPT) para trazar trayectorias de una sola molécula y, a continuación, ajustamos las trayectorias a un modelo de unión proteína-gota para extraer la RT media de la proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos donde se aplicó este método de imagen de una sola molécula para comparar los RT medios de una proteína en sus condensados de LLPS cuando se fusiona y no se fusiona con un dominio oligomerizante. Este protocolo es ampliamente aplicable a la medición de la dinámica de interacción de cualquier proteína que participe en LLPS.

Introducción

Un creciente cuerpo de trabajo sugiere que los condensados biomoleculares juegan un papel importante en la organización celular y numerosas funciones celulares, por ejemplo, la regulación transcripcional 1,2,3,4,5, la reparación del daño del ADN ^6,7,8, la organización de la cromatina 9,10,11,12, el cromosoma X <....

Protocolo

1. Marcaje de proteínas en células

1. Exprese la proteína de interés fusionada a HaloTag en la línea celular deseada.
2. Exprese de manera estable H2B marcado con Halo en el mismo tipo de células que en 1.1 utilizando transposones o transducción viral.

2. Preparación de cubreobjetos

1. Antes de usar cubreobjetos para cultivos celulares, límpielos para eliminar los contaminantes autofluorescentes.
   1. Monte los cubreobjetos #1.5 de 25 mm de diámetro en una rejilla de tinción de cerámica y colóquelos en un recipiente de polipropileno.
   2. Sumerja completamente los cubreobj....

Discusión

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para sistemas como los investigados en Irgen-Gioro et ^al.40. Dependiendo de la aplicación, se pueden modificar algunos componentes del protocolo, por ejemplo, el método para generar líneas celulares marcadas con fluorescencia, el sistema de etiquetado fluorescente y el estilo de cubreobjetos utilizado. El marcaje con halo de una proteína en una célula se puede realizar utilizando dos estrategias, dependiendo de cuál sea más adecuada para un.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips