생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

요약

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

초록

액체-액체 상 분리(LLPS)를 통해 형성된 생체 분자 응축물은 세포 조직과 증가하는 세포 기능에 중요한 것으로 간주되어 왔습니다. 살아있는 세포의 LLPS를 특성화하는 것도 중요한데, 비정상적인 응축은 암 및 신경퇴행성 질환을 포함한 수많은 질병과 관련이 있기 때문입니다. LLPS는 종종 본질적으로 무질서한 단백질 간의 선택적, 일시적 및 다가 상호 작용에 의해 주도됩니다. LLPS에 참여하는 단백질의 상호 작용 역학은 결합 체류 시간(RT), 즉 응축수 내에서 결합하는 데 소비하는 시간의 양으로 잘 요약됩니다. 여기에서는 응축수 내 특정 단백질의 평균 RT를 측정할 수 있는 살아있는 세포 단일 분자 이미징을 기반으로 하는 방법을 제시합니다. 개별 단백질 분자와 이들이 연관된 응축물을 동시에 시각화하고, 단일 입자 추적(SPT)을 사용하여 단일 분자 궤적을 표시한 다음, 단백질의 평균 RT를 추출하기 위해 단백질 액적 결합 모델에 궤적을 맞춥니다. 마지막으로, 이 단일 분자 이미징 방법을 적용하여 올리고머화 도메인에 융합 및 비융합될 때 LLPS 응축물에서 단백질의 평균 RT를 비교한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 LLPS에 참여하는 모든 단백질의 상호 작용 역학을 측정하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

서문

점점 더 많은 연구가 생체 분자 응축물이 세포 조직과 수많은 세포 기능(예: 전사 조절 ^1,2,3,4,5, DNA 손상 복구 ^6,7,8, 염색질 조직 9,10,11,12, X-염색체)에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다 불활화 ^13,14,15 및 세포 내 신호 16,17,18.<....

프로토콜

1. 세포 내 단백질 라벨링

1. 원하는 세포주에서 HaloTag에 융합된 관심 단백질을 발현합니다.
2. 트랜스포손(transposon) 또는 바이러스 형질도입(viral transduction)을 사용하여 1.1과 동일한 유형의 세포에서 Halo-tagged H2B를 안정적으로 발현합니다.

2. 커버슬립의 준비

1. 세포 배양에 커버슬립을 사용하기 전에 커버슬립을 청소하여 자가형광 오염 물질을 제거하십시오.
   1. 직경 25mm, #1.5 커버슬립을 세라믹 염색 랙에 장착하고 폴리프로필렌 용기에 넣습니다.
   2. 커버슬립을 KOH의 1M 용액에 완전히 담그고 1시간 동안 초음파 처리합니다.
   3. 커버슬립을 이중 증류수(ddH₂O)로 세 번 헹굽니다.
   4. 커버슬립을 100% 에탄올에 완전히 담그고 1시간 동안 초음파 처리합니다.
   5. 커버슬립을 ddH_2O로 희석한 20% 에탄올에 완전히 담그고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.

3. 현미경....

토론

여기에 제시된 프로토콜은 Irgen-Gioro et ^al.40에서 조사된 것과 같은 시스템을 위해 설계되었습니다. 응용 분야에 따라 프로토콜의 일부 구성 요소(예: 형광 표지 세포주 생성 방법, 형광 표지 시스템 및 사용되는 커버슬립 스타일)를 수정할 수 있습니다. 세포에서 단백질의 Halo-tagging은 주어진 실험에 더 적합한 전략에 따라 두 가지 전략을 사용하여 수행할 수 있습니다. 1) 외인성 발.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips