生物分子缩合物中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

摘要

许多固有的无序蛋白质已被证明参与高动态生物分子凝聚物的形成，这种行为对许多细胞过程很重要。在这里，我们提出了一种基于单分子成像的方法，用于量化活细胞中生物分子缩合物中蛋白质相互作用的动力学。

摘要

通过液-液相分离 （LLPS） 形成的生物分子缩合物被认为在细胞组织和越来越多的细胞功能中至关重要。表征活细胞中的LLPS也很重要，因为异常凝聚与许多疾病有关，包括癌症和神经退行性疾病。LLPS 通常由内在无序蛋白质之间的选择性、瞬时性和多价相互作用驱动。非常令人感兴趣的是参与LLPS的蛋白质的相互作用动力学，通过测量它们的结合停留时间（RT），即它们在缩合物中结合的时间，可以很好地总结出来。在这里，我们提出了一种基于活细胞单分子成像的方法，该方法使我们能够测量缩合物中特定蛋白质的平均RT。我们同时可视化单个蛋白质分子及其与之相关的缩合物，使用单颗粒跟踪 （SPT） 绘制单分子轨迹，然后将轨迹拟合到蛋白质-液滴结合模型以提取蛋白质的平均 RT。最后，我们展示了代表性结果，其中应用这种单分子成像方法比较蛋白质在其 LLPS 缩合物下融合和未融合到寡聚结构域时的平均 RT。该协议广泛适用于测量参与LLPS的任何蛋白质的相互作用动力学。

引言

越来越多的研究表明，生物分子凝聚物在细胞组织和众多细胞功能中起着重要作用，例如转录调控^{1、2、3、4、5}、DNA 损伤修复^6、7、8、染色质组织^{9、10、11、12}、X 染色体失活 ^13,14,15 和细胞内信号转导 16,17,18。

研究方案

1. 细胞中蛋白质的标记

1. 在所需细胞系中表达与 HaloTag 融合的目标蛋白。
2. 使用转座子或病毒转导在与 1.1 相同类型的细胞中稳定表达带有 Halo 标签的 H2B。

2. 盖玻片的制备

1. 在使用盖玻片进行细胞培养之前，清洁盖玻片以去除自发荧光污染物。
   1. 将直径为 25 mm 的 #1.5 盖玻片安装在陶瓷染色架上，然后放入聚丙烯容器中。
   2. 将盖玻片完全浸入1M的KOH溶液中并超声处理1小时。
   3. 用双蒸水（ddH₂O）冲洗盖玻片三次。
   4. 将盖玻片完全浸入100%乙醇中并超声处理1小时。
   5. 将盖玻片完全浸入用ddH₂O稀释的20%乙醇中，并在4°C下储存直至使用。

3. 显微镜细胞的制备

注意：在生物安全柜中执行本节中的步骤，以防止细胞污染。

1. 将细胞铺在清洁的盖玻片上。如果要瞬时表达 Halo 标记的蛋白质，请在成像前 2 天进行。如果 Halo 标记的蛋白质稳定或内源性表达，则在成像前 1 天进行。

讨论

这里介绍的协议是为Irgen-Gioro等人⁴⁰中研究的系统而设计的。根据应用的不同，可以修改方案的某些组件，例如，生成荧光标记细胞系的方法、荧光标记系统以及使用的盖玻片样式。细胞中蛋白质的光晕标记可以使用两种策略来完成，具体取决于哪种策略更适合给定的实验。1） 外源表达：将目标蛋白融合到 HaloTag 中，并在靶细胞系中使用转染瞬时表达或使用转座子或病毒转导稳?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips