מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

Summary

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

Abstract

עיבויים ביומולקולריים הנוצרים באמצעות הפרדת פאזות נוזלית-נוזלית (LLPS) נחשבו קריטיים בארגון התא ובמספר גדל והולך של תפקודים תאיים. אפיון LLPS בתאים חיים חשוב גם משום שעיבוי חריג נקשר למחלות רבות, כולל סרטן והפרעות נוירודגנרטיביות. LLPS מונע לעתים קרובות על ידי אינטראקציות סלקטיביות, חולפות ורב-ערכיות בין חלבונים בעלי הפרעה מהותית. עניין רב הם דינמיקת האינטראקציה של חלבונים המשתתפים LLPS, אשר מסוכמים היטב על ידי מדידות של זמן המגורים מחייב שלהם (RT), כלומר, כמות הזמן שהם מבלים קשורים בתוך condensates. כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על הדמיה של מולקולה בודדת של תאים חיים המאפשרת לנו למדוד את RT הממוצע של חלבון מסוים בתוך מעובים. אנו מדמיינים בו זמנית מולקולות חלבון בודדות ואת המעבים שאליהם הן משויכות, משתמשים במעקב אחר חלקיק יחיד (SPT) כדי לשרטט מסלולים של מולקולה בודדת, ולאחר מכן מתאימים את המסלולים למודל של קשירת טיפות חלבון כדי לחלץ את RT הממוצע של החלבון. לבסוף, אנו מראים תוצאות מייצגות שבהן שיטת הדמיה זו של מולקולה בודדת יושמה כדי להשוות את ממוצע RTs של חלבון בעיבוי LLPS שלו כאשר הוא מאוחה ולא מאוחה לתחום אוליגומריזציה. פרוטוקול זה ישים באופן נרחב למדידת דינמיקת האינטראקציה של כל חלבון המשתתף ב- LLPS.

Introduction

גוף הולך וגדל של עבודות מצביע על כך שמעבים ביומולקולריים ממלאים תפקיד חשוב בארגון התא ובתפקודים תאיים רבים, למשל, ויסות שעתוק 1,2,3,4,5, תיקון נזק לדנ"א ^6,7,8, ארגון הכרומטין ^9,10,11,12, כרומוזום X השבתה 13,14,15 ואיתות תוך-תאי

Protocol

1. תיוג חלבונים בתאים

1. בטא את החלבון המעניין המאוחה ל- HaloTag בקו התאים הרצוי.
2. בטא ביציבות H2B מתויג בהילה באותו סוג תאים כמו ב-1.1 באמצעות טרנספוזונים או התמרה ויראלית.

2. הכנת כיסויים

1. לפני השימוש בכיסויים לתרבית תאים, יש לנקות את הכיסויים כדי להסיר מזהמים אוטופלואורסצנטיים.
   1. הר בקוטר 25 מ"מ, #1.5 מכסה מחליקים על מתלה צביעה קרמית ומניחים במיכל פוליפרופילן.
   2. יש לטבול לחלוטין את החלקות הכיסוי בתמיסת KOH באורך 1 מ' ולסניק למשך שעה.
   3. יש לשטוף את החלקות שלוש פעמים במים מזוקקים פעמיים (ddH₂O).
   4. יש לטבול לחלוטין את החלקות הכיסוי בא....

תוצאות

כאן, אנו מציגים תוצאות מייצגות של Irgen-Gioro et ^al.40, שם השתמשנו בפרוטוקול SPT זה כדי להשוות את דינמיקת האינטראקציה של שני חלבונים במעבי LLPS בהרכבה עצמית שלהם. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) מכיל IDR שיכול לעבור LLPS עם ביטוי יתר בתאים אנושיים. שיערנו כי מיזוג TAF15(IDR) ל-FTH1 (שרשרת פריטין כבדה 1), ?.......

Discussion

הפרוטוקול כפי שהוא מוצג כאן מיועד למערכות כמו אלה שנחקרו ב-Irgen-Gioro et ^al.40. בהתאם ליישום, ניתן לשנות רכיבים מסוימים של הפרוטוקול, למשל, השיטה ליצירת קווי תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי, מערכת התיוג הפלואורסצנטי וסגנון הכיסוי שבו נעשה שימוש. תיוג הילה של חלבון בתא יכול להיעשות בא?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips