JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

Abstract

עיבויים ביומולקולריים הנוצרים באמצעות הפרדת פאזות נוזלית-נוזלית (LLPS) נחשבו קריטיים בארגון התא ובמספר גדל והולך של תפקודים תאיים. אפיון LLPS בתאים חיים חשוב גם משום שעיבוי חריג נקשר למחלות רבות, כולל סרטן והפרעות נוירודגנרטיביות. LLPS מונע לעתים קרובות על ידי אינטראקציות סלקטיביות, חולפות ורב-ערכיות בין חלבונים בעלי הפרעה מהותית. עניין רב הם דינמיקת האינטראקציה של חלבונים המשתתפים LLPS, אשר מסוכמים היטב על ידי מדידות של זמן המגורים מחייב שלהם (RT), כלומר, כמות הזמן שהם מבלים קשורים בתוך condensates. כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על הדמיה של מולקולה בודדת של תאים חיים המאפשרת לנו למדוד את RT הממוצע של חלבון מסוים בתוך מעובים. אנו מדמיינים בו זמנית מולקולות חלבון בודדות ואת המעבים שאליהם הן משויכות, משתמשים במעקב אחר חלקיק יחיד (SPT) כדי לשרטט מסלולים של מולקולה בודדת, ולאחר מכן מתאימים את המסלולים למודל של קשירת טיפות חלבון כדי לחלץ את RT הממוצע של החלבון. לבסוף, אנו מראים תוצאות מייצגות שבהן שיטת הדמיה זו של מולקולה בודדת יושמה כדי להשוות את ממוצע RTs של חלבון בעיבוי LLPS שלו כאשר הוא מאוחה ולא מאוחה לתחום אוליגומריזציה. פרוטוקול זה ישים באופן נרחב למדידת דינמיקת האינטראקציה של כל חלבון המשתתף ב- LLPS.

Introduction

גוף הולך וגדל של עבודות מצביע על כך שמעבים ביומולקולריים ממלאים תפקיד חשוב בארגון התא ובתפקודים תאיים רבים, למשל, ויסות שעתוק 1,2,3,4,5, תיקון נזק לדנ"א 6,7,8, ארגון הכרומטין 9,10,11,12, כרומוזום X השבתה 13,14,15 ואיתות תוך-תאי 16,17,18. בנוסף, חוסר ויסות של עיבוי ביומולקולרי מעורב במחלות רבות, כולל סרטן 19,20,21 והפרעות נוירודגנרטיביות 22,23,24,25,26. היווצרות קונדנסט מונעת לעתים קרובות על ידי אינטראקציות חלבון-חלבון חולף, סלקטיבי ורב-ערכי, חומצת חלבון-גרעין, או חומצת גרעין-חומצת גרעין27. בתנאים מסוימים, אינטראקציות אלה יכולות להוביל להפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS), מעבר צפיפות המעשיר באופן מקומי ביומולקולות ספציפיות בטיפות חסרות ממברנה. אינטראקציות רב-ערכיות כאלה מתווכות לעתים קרובות על ידי האזורים הלא מסודרים במהותם (IDR) של חלבונים 1,28,29. אפיון ביופיזי של אינטראקציות אלה ברמה המולקולרית הוא קריטי להבנתנו של תפקודים תאיים בריאים וחריגים רבים, בהתחשב בהתפשטות המעבים לאורכם. למרות שטכניקות המבוססות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי, כגון שחזור פלואורסצנטי לאחר הלבנה פוטו-אקונומית (FRAP)30,31,32, היו בשימוש נרחב כדי להראות באופן איכותי כי חילופי המולקולריות בין המעבים והסביבה התאית הסובבת הם דינמיים, כימות דינמיות האינטראקציה של ביומולקולות ספציפיות בתוך עיבוי אינו אפשרי בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונקונבנציונלי או מולקולה בודדת מיקרוסקופיה ללא שיטות ניתוח נתונים מיוחדות. טכניקת המעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) המתוארת בפרוטוקול זה מבוססת על מיקרוסקופ חד-מולקולה של תא חי33 ומספקת כלי רב עוצמה ייחודי לכימות דינמיקת האינטראקציה בין חלבונים ספציפיים בתוך קונדנסטים. הקריאה של SPT למדידה כזו היא זמן השהייה הממוצע של חלבון בעל עניין במעבה.

ניתן לחלק את הפרוטוקול לשני חלקים - רכישת נתונים וניתוח נתונים. השלב הראשון של איסוף נתוני הדמיה הוא לבטא בתאים חלבון מעניין המאוחה ל- HaloTag34. זה מאפשר תיוג של החלבון המעניין עם שני פלואורופורים, כאשר רוב מולקולות החלבון יסומנו עם פלואורופור שאינו ניתן להפעלה (למשל, JFX549 Halo ligand35) וחלק קטן מהן יסומן עם פלואורופור מובחן ספקטרלית וניתן להפעלה (למשל, PA-JF646 Halo ligand36). זה מאפשר רכישה בו זמנית של כל מיקומי העיבוי בתא ורכישה של יריעות של מולקולה בודדת של חלבון העניין נקשר ולא נקשר למעבים. בינתיים, אותו סוג של תאים משתנים כדי לבטא ביציבות H2B מתויג Halo, היסטון כי הוא בעיקר חסר תנועה על כרומטין. לאחר מכן התאים מוכתמים בליגנד Halo PA-JF646 כדי לאפשר הדמיה של H2B במולקולה אחת. כפי שיפורט בפירוט בהמשך, ניסוי זה מסביר את תרומתה של הלבנה לאור כדי לאפשר כימות מדויק של דינמיקת האינטראקציה של החלבון המעניין. לאחר מכן יש לגדל תאים לניסויי הדמיה בתרבית על גבי כיסויים נקיים, להיות מוכתמים בליגנד(ים) של HaloTag ולהרכיב אותם לתא הדמיה של תאים חיים. משם, הדגימה מצולמת תחת הארה של יריעה אופטית משופעת ולמינציה (HILO) במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) המסוגל לבצע הדמיה דו-ערוצית וזיהוי של מולקולה יחידה. לאחר מכן הפליטה מפוצלת לשתי מצלמות, אחת עוקבת אחר מיקומי עיבוי ואחת עוקבת אחר מולקולות בודדות. הרכישה מתבצעת עם זמן אינטגרציה ארוך (בסדר גודל של מאות מילישניות) כדי לטשטש חלבונים המתפזרים בחופשיות וללכוד רק חלבונים שהם פחות ניידים עקב קשירה למבנים יציבים בתא37.

השלב הראשון של ניתוח נתונים הוא שימוש באלגוריתם מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT)38,39 כדי למקם מולקולות חלבון בודדות בכל פריים של הסרט ולהרכיב את הלוקליזציות למסלול עבור כל מולקולה לאורך חייה הניתנים לגילוי. לאחר מכן ממיינים את המסלולים לאלה המייצגים מולקולות בפנים ולאלה המייצגים מולקולות מחוץ למעבים על ידי השוואת הלוקליזציה של המולקולות לאורך מסלוליהן ללוקליזציה של כל המעבים בזמנים המתאימים1.

לאחר מכן, עקומת הישרדות (1 - CDF) נוצרת באמצעות האורכים של כל המסלולים בעיבוי. זמן המגורים הממוצע לכאורה של המולקולות מופק לאחר מכן על ידי התאמת עקומת ההישרדות למודל המעריכי הדו-רכיבי הבא של קשירת חלבונים,

figure-introduction-4960,

עם A כשבר של מולקולות שאינן קשורות באופן ספציפי ועם kobs,ns ו - kobs,s כשיעורי הדיסוציאציה הנצפים של מולקולות שאינן קשורות באופן ספציפי וקשורות ספציפית, בהתאמה. רק kobs,s נחשב מכאן והלאה. הדינמיקה של דיסוציאציה חלבונית, ktrue,s, ופוטו-הלבנה של הפלואורופור, kpb, תורמות ל-kobs,s כמו

figure-introduction-5523;

לכן, כדי לבודד את ההשפעות של דיסוציאציה חלבונית, נמדד שיעור הדיסוציאציה הספציפי של H2B-Halo בקו התאים שהוזכר קודם.

figure-introduction-5784

H2B הוא חלבון המשולב ביציבות בכרומטין וחווה דיסוציאציה מינימלית בסקאלת הזמן של רכישת סרט בעל מולקולה בודדת37. קצב הדיסוציאציה הספציפי שלו שווה אז לקצב ההלבנה של ליגנד ההילה PA-JF646, או

figure-introduction-6139.

זמן השהייה הממוצע בעיבוי של החלבון המעניין, figure-introduction-6301, הוא אז

figure-introduction-6426.

מוצגות תוצאות מייצגות של Irgen-Gioro et al.40 , כאשר פרוטוקול זה יושם כדי להראות כי מיזוג תחום אוליגומריזציה ל- IDR גורם לזמני שהייה ארוכים יותר של IDR במעבים שלו. תוצאה זו מצביעה על כך שתחום האוליגומריזציה הנוסף מייצב את האינטראקציות ההומוטיפיות של IDR המניע LLPS. באופן עקרוני, ניתן ליישם את אותה שיטה עם פרוטוקולים מעט שונה כדי לאפיין את האינטראקציות ההומוטיפיות או ההטרוטיפיות של כל חלבון המשתתף בהיווצרות של כל סוגי המעבים.

Protocol

1. תיוג חלבונים בתאים

  1. בטא את החלבון המעניין המאוחה ל- HaloTag בקו התאים הרצוי.
  2. בטא ביציבות H2B מתויג בהילה באותו סוג תאים כמו ב-1.1 באמצעות טרנספוזונים או התמרה ויראלית.

2. הכנת כיסויים

  1. לפני השימוש בכיסויים לתרבית תאים, יש לנקות את הכיסויים כדי להסיר מזהמים אוטופלואורסצנטיים.
    1. הר בקוטר 25 מ"מ, #1.5 מכסה מחליקים על מתלה צביעה קרמית ומניחים במיכל פוליפרופילן.
    2. יש לטבול לחלוטין את החלקות הכיסוי בתמיסת KOH באורך 1 מ' ולסניק למשך שעה.
    3. יש לשטוף את החלקות שלוש פעמים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O).
    4. יש לטבול לחלוטין את החלקות הכיסוי באתנול 100% ולבצע סוניקט למשך שעה אחת.
    5. יש לטבול לחלוטין את הכיסויים באתנול 20% מדולל ב-ddH2O ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.

3. הכנת תאים למיקרוסקופ

הערה: בצע שלבים מסעיף זה בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום של התאים.

  1. תאי צלחת על כיסויים מנוקים. יש לבצע יומיים לפני ההדמיה אם החלבון המתויג בהילה מתבטא באופן ארעי. יש לבצע יום אחד לפני ההדמיה אם החלבון המתויג בהילה מתבטא בצורה יציבה או אנדוגנית.
    1. השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להניח את הכיסויים בצלחת בעלת 6 בארות (כיסוי אחד/באר לכל דגימת תא) ואפשרו לשאריות אתנול להתאדות.
    2. צלחת כל באר עם מספר מתאים של תאים כדי להשיג 70% מפגש בזמן ההדמיה. צלחת באר נוספת עם תאים המבטאים ביציבות H2B-Halo עם אותו מפגש מטרה.
    3. בצע שלב זה רק אם אתה מבטא באופן זמני את החלבון המסומן ב- Halo של עניין. לדגור על תאים במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר מכן, העבר את התאים עם פלסמיד המקודד את החלבון המתויג של עניין באמצעות ריאגנטים transfection מתאים בעקבות הנחיות היצרן.
    4. לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
  2. צבעו את התאים המבטאים את החלבון המסומן ב-Halo כבעל תווית הילה הן עם ליגנד Halo שאינו ניתן להפעלה פוטו-אקוסטית (למשל, JFX549) והן עם ליגנד Halo הניתן להפעלה פוטו-אקוסטית (למשל, PA-JF646). תאי צביעה המבטאים H2B-Halo רק עם ליגנד Halo הניתן להפעלה פוטואקטיבית.
    הערה: יש להשתמש בריכוזים של ליגנדות Halo המפורטות כאן כנקודת התחלה; הריכוז האופטימלי יהיה תלוי ברמת הביטוי ובריכוז המקומי המעובה של החלבון המעניין.
    1. עבור כל דגימת תא המבטאת את החלבון המתויג בהילה, יש לדלל 100 ננומטר JFX549 ליגנד Halo35 ו-20 ננומטר PA-JF646 ליגנד Halo36 ב-500 מיקרוליטר של מדיה תאית מתאימה. עבור כל דגימה המבטאת H2B-Halo, יש לדלל רק 20 ננומטר PA-JF646 Halo ligand ב-500 μL של מדיה תאית מתאימה.
    2. עבור כל באר, יש לשאוף מדיה קיימת, להוסיף 2 מ"ל של PBS 1x, ואז לשאוף PBS (פעולה זו מכונה "שטיפה" לשארית הפרוטוקול), ולהחליף במדיה המכילה את ליגנדות Halo המתאימות.
    3. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
    4. יש לשטוף עם PBS ארבע פעמים ולהחליף במדיה חדשה שאינה מכילה ליגנדות Halo.
    5. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
    6. חזור על שלבים 3.2.4 ו- 3.2.5 שלוש פעמים (ארבעה מחזורי דגירה בסך הכל).
    7. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הכיסוי עם תאים לתא כיסוי תרבית תאים התואם לשלב המיקרוסקופ.
    8. הוסף מדיה ללא פנול אדום לתא והמשך להדמיה. יש לדגור על הדגימות שלא מצולמות באופן מיידי בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 עד לצורך.

4. הדמיה של מולקולה בודדת

הערה: ניסויים עצמאיים המודדים את זמני השהייה הן של H2B והן של החלבון המעניין צריכים להתבצע על פני מספר ימים (≥3) כדי להפיק תוצאות מובהקות סטטיסטית. לפני הדמיה של דגימות תאים במיקרוסקופ, יש ליישר את שתי המצלמות באמצעות מיקרוספרות מוכתמות בגודל 0.1 מיקרומטר (Table of Materials) או תקן כיול דומה.

  1. הכינו את המיקרוסקופ.
    1. הפעל את המיקרוסקופ ואת המחשב השולט במיקרוסקופ.
    2. הפעל רכיבי דגירה של תאים חיים (תנור חימום ו- CO2) במיקרוסקופ והגדר אותו ל- 37 ° C ו- 5% CO2. לאפשר למערכת להתאזן.
    3. שים טיפה של השמן המתאים על יעד טבילה שמן 100x TIRF על המיקרוסקופ ולטעון את דגימת התא על שלב המיקרוסקופ.
  2. זהה תא לתמונה.
    1. ציירו את דוגמת התא תחת תאורת שדה בהיר וכווננו את מיקום z עד שהתאים יהיו ממוקדים.
    2. זהה תא בעל מאפיינים מורפולוגיים של תאים בריאים.
    3. חתוך את שדה הראייה (FOV) כך שהוא ילכוד רק את גרעין תא היעד.
    4. השתמש בתאורת לייזר וכוונן את זווית TIRF עד להשגת תאורת HILO41 עם יחס אות לרעש אופטימלי של מולקולות בודדות.
  3. תמונה H2B-Halo בתאים חיים.
    הערה: כוחות הלייזר המשמשים בסעיף זה הם ספציפיים לניסוי זה ונכללים כדוגמה. יש לבחור סמכויות לייזר מתאימות על פי הקריטריונים המפורטים בדיון.
    1. הגדר תצורת רכישה באופן הבא. הגדר את זמן החשיפה כ- 500 אלפיות השנייה. במהלך כל חשיפה של 500 מילישניות, עוררו את מולקולות PA-JF646 המסומנות כ-H2B-Halo עם קרן של 9.1 mW, 640 ננומטר. במהלך הזמן המת בין פריימים (158.01 μs במערכת ההדמיה המשמשת כאן), פוטו-הפעל את המולקולות עם קרן של 111 μW, 405 ננומטר.
    2. צלם 2000 מסגרות ברציפות תחת הגדרות אלה. הגדילו בהדרגה את עוצמת הקרן של 405 ננומטר במהלך הרכישה כאשר מספר המולקולות הפוטואקטיביות הופך לבלתי מספיק.
  4. דמיינו את החלבון המתויג בהילה שמעניין תאים חיים.
    1. השתמש במראה דיכרואית בעלת מעבר ארוך כדי לפצל אורכי גל פליטה בין שתי מצלמות, אחת כדי לזהות PA-JF646 והשנייה כדי לזהות JFX549. השתמש במסנני פליטה מתאימים מול המצלמות.
    2. השתמש באותה תצורת רכישה המתוארת ב- 4.3.1 עם השינוי הבא. הוסף ערוץ JFX549 נוסף כדי לעקוב אחר המיקומים של החלבון המתויג ב- Halo מתעבה לאורך זמן. כל 10 שניות, לרכוש מסגרת אחת (500 ms, 2.1 mW, 561 ננומטר עירור) בערוץ JFX549 תוך שמירה על רכישת ערוץ PA-JF646. זה יגרום לדמם לתוך ערוץ PA-JF646, אשר יטופל בניתוח הנתונים שלאחר הרכישה.
    3. צלם 2000 מסגרות ברציפות תחת הגדרות אלה. הגדילו בהדרגה את עוצמת הקרן של 405 ננומטר במהלך הרכישה כאשר מספר המולקולות הפוטואקטיביות הופך לבלתי מספיק.

5. ניתוח נתוני הדמיה של מולקולה בודדת

הערה: הפרמטרים המשמשים לאורך סעיף 5 הם ספציפיים לניסוי זה ונכללים כדוגמה. יש לבחור פרמטרים מתאימים על פי הקריטריונים המפורטים בדיון.

  1. הכן נתוני הדמיה גולמיים לעיבוד.
    1. לקבלת הנתונים של החלבון המעניין, המירו כל ערוץ מקובץ נתוני ההדמיה הגולמיים לקובץ .tif עצמאי באמצעות ImageJ או תוכנת עיבוד תמונה דומה. עבור הנתונים של H2B, המר את הערוץ היחיד מקובץ נתוני ההדמיה הגולמיים לקובץ .tif באותו אופן.
      הערה: בהתאם לתוכנת הרכישה שבה נעשה שימוש, יכולות להיות מסגרות ריקות בסרט העיבוי, מכיוון שרק מסגרת אחת למעקב אחר עיבוי מצולמת כל 10 שניות. יש לאכלס את המסגרות הריקות במסגרת העיבוי העדכנית ביותר (תוכנות רכישה מסוימות עושות זאת באופן אוטומטי). בנוסף, אם יש דימום משמעותי מתעלת העיבוי (JFX549) לערוץ המולקולה הבודדת (PA-JF646) במהלך מסגרות מעקב עיבוי אלה, יש להחליף את מסגרות המולקולה הבודדת המתאימות במסגרת המולקולה הבודדת העדכנית ביותר.
    2. אם יש מסגרות שיש להחליף באחד מהסרטים עקב הסיבות לעיל, החלף אותן במסגרת העדכנית ביותר מסרט זה על-ידי שינוי (במידת הצורך) והפעלת pretracking_comb.txt, מאקרו ImageJ הזמין ב- Chong et al.1 וביצוע ההנחיות.
  2. צור מסלולים של חלקיק יחיד באמצעות תוכנת SPT, לדוגמה, SLIMfast39, יישום GUI של אלגוריתם MTT38 הזמין ב- Teves et al.42.
    1. טען את הקובץ מ- 5.1.2 המכיל את הסרט בעל המולקולה היחידה ב- SLIMfast על ידי לחיצה על טען >- Imagestack.
    2. הגדר את הפרמטרים (שיעור שגיאות לוקליזציה: 10-6; לולאות דפלציה: 3) עבור לוקליזציה על ידי לחיצה על > OPT גיליון: לוקליזציה.
    3. הגדר את הפרמטרים (שיא פליטה: 664 ננומטר; זמן השהיה: 500 אלפיות השנייה) לרכישה על-ידי לחיצה על > OPT Sheet: Acquisition.
    4. דמיינו את הלוקליזציה של כל המולקולות במסגרת אחת כדי לוודא שהפרמטרים שנבחרו מתאימים (TEST LOC). אם הדבר אינו מתאים, שנה פרמטרים בשלבים 5.2.2 ו- 5.2.3 וחזור על שלב זה.
    5. צור קובץ המכיל לוקליזציה של כל המולקולות בכל מסגרת (LOC ALL).
    6. טען את הקובץ מ- 5.2.5 ב- SLIMfast על ידי לחיצה על טען נתוני חלקיקים > >- SLIMfast.
    7. הגדר את הפרמטרים (מקדם דיפוזיה מרבי צפוי: 0.1 מיקרומטר2/s; מספר מרבי של מתחרים: 5) ליצירת מסלול על ידי לחיצה על > OPT Sheet: Tracking.
    8. צור קובץ המכיל את המסלולים של כל המולקולות (GEN TRAJ).
  3. סנן את המסלולים הקצרים מ- t min, 2.5 s, באמצעות evalSPT39, הזמין ב- Drosopoulos et al.43, כדי לקחת בחשבון שגיאות מעקב הגורמות למסלולים קצרים באופן מלאכותי.
    1. טען את הקובץ מ- 5.2.8 ל- evalSPT (+ קובץ > מ- 5.2.8 > אישור).
    2. הגדר את הפרמטרים (מינימום: 5 מסגרות; מרבי: אורך מסלול מרבי עבור קובץ מ- 5.2.8) כדי לסנן את המסלולים הקצרים מ- 2.5 שניות.
    3. צור קובץ עם כל המסלולים המסוננים (ייצוא נתונים).
  4. בצע שלב זה עבור מסלולי החלבון המעניין בלבד. מיין את המסלולים לאלה שבעיבוי ומחוץ למעבים, ולאחר מכן חלץ את זמן השהייה הממוצע בעיבוי.
    הערה: כל הקודים עבור סעיף זה זמינים ב- Chong et al.1.
    1. סף את כל מסגרות הסרט שנרכשו בערוץ JFX549 כדי ליצור סרט קיטועי זמן המאוכלס במסיכה בינארית המתפתחת בזמן המדגישה מיקומי עיבוי על-ידי הפעלת המאקרו, הגרעין ו mask_v2.txt האשכול של ImageJ וביצוע ההנחיות.
    2. פרמט מחדש את מסלולי המולקולה הבודדת שנוצרו ב- 5.3.3. שימוש בסקריפט MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, והתאמת שמות הקבצים, הנתיבים והפרמטרים לפי הצורך. (פרמטרים: חשיפה, 0.5 שניות; רזולוציה, 0.16 מיקרומטר לפיקסל).
    3. מיין מסלולים בהתבסס על שבריר החיים שמולקולה נתונה מבלה בעיבוי, F, באמצעות סקריפט MATLAB, categorization_v4.m, והתאמת שמות הקבצים והנתיבים לפי הצורך.
    4. המשך להשתמש רק במסלולים בעיבוי.
  5. חלץ kobs,s ו - kpb וחשב את זמן המגורים הממוצע המתוקן, figure-protocol-10155.
    1. חלץ kobs,s מהחלבון המעובה של מסלולי עניין באמצעות סקריפט MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, והתאמת שמות קבצים, נתיבים ופרמטרים לפי הצורך.
      (פרמטרים: חשיפה, 0.5 שניות; StartFrameForFit, 5 מסגרות).
    2. חלץ kpb ממסלולי H2B באמצעות סקריפט MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, והתאם שמות קבצים, נתיבים ופרמטרים לפי הצורך.
      (פרמטרים: חשיפה, 0.5 שניות; StartFrameForFit, 5 מסגרות).
    3. חישוב זמן השהייה הממוצע המתוקן של חלבון הריבית הקשור באופן ספציפי למעבים שלו, figure-protocol-10865כ- ,
      figure-protocol-10961
      הערה: יש לבצע בקרות כדי לוודא שזמני חשיפה שונים ארוכים מספיק כדי לטשטש חלקיקים ניידים, לדוגמה, 300 אלפיות השנייה ו- 800 אלפיות השנייה, עדיין גורמים לאותו זמן שהייה ממוצע של החלבון המעניין.

תוצאות

כאן, אנו מציגים תוצאות מייצגות של Irgen-Gioro et al.40, שם השתמשנו בפרוטוקול SPT זה כדי להשוות את דינמיקת האינטראקציה של שני חלבונים במעבי LLPS בהרכבה עצמית שלהם. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) מכיל IDR שיכול לעבור LLPS עם ביטוי יתר בתאים אנושיים. שיערנו כי מיזוג TAF15(IDR) ל-FTH1 (שרשרת פריטין כבדה 1), ?...

Discussion

הפרוטוקול כפי שהוא מוצג כאן מיועד למערכות כמו אלה שנחקרו ב-Irgen-Gioro et al.40. בהתאם ליישום, ניתן לשנות רכיבים מסוימים של הפרוטוקול, למשל, השיטה ליצירת קווי תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי, מערכת התיוג הפלואורסצנטי וסגנון הכיסוי שבו נעשה שימוש. תיוג הילה של חלבון בתא יכול להיעשות בא?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע במסגרת מענק מס '. DGE-1745301 (S.Y.), פרס Pew-Stewart Scholar (S.C.), פרס Searle Scholar (S.C.), מענק המחקר של קרן Shurl and Kay Curci (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), מענק המחקר Mallinckrodt (S.C.) ומרגרט א. מענק Early Medical Research Trust לשנת 2024 (S.C). S.C. נתמך גם על ידי NIH/NCI תחת פרס מספר P30CA016042.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

References

  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030 (2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379 (2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474 (2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049 (2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787 (2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -. T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776 (2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357 (2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903 (2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280 (2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329 (2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved