Mesure à molécule unique de la dynamique d’interaction des protéines dans les condensats biomoléculaires

Résumé

Il a été démontré que de nombreuses protéines intrinsèquement désordonnées participent à la formation de condensats biomoléculaires hautement dynamiques, un comportement important pour de nombreux processus cellulaires. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie à molécule unique pour quantifier la dynamique par laquelle les protéines interagissent les unes avec les autres dans les condensats biomoléculaires des cellules vivantes.

Résumé

Les condensats biomoléculaires formés par séparation de phase liquide-liquide (LLPS) ont été considérés comme essentiels à l’organisation cellulaire et à un nombre croissant de fonctions cellulaires. La caractérisation des LLPS dans les cellules vivantes est également importante car la condensation aberrante a été liée à de nombreuses maladies, notamment les cancers et les troubles neurodégénératifs. La LLPS est souvent pilotée par des interactions sélectives, transitoires et multivalentes entre des protéines intrinsèquement désordonnées. La dynamique d’interaction des protéines participant aux LLPS est d’un grand intérêt, car elle est bien résumée par des mesures de leur temps de séjour de liaison (RT), c’est-à-dire le temps qu’elles passent lié dans les condensats. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie de cellules vivantes à molécule unique qui nous permet de mesurer la RT moyenne d’une protéine spécifique dans les condensats. Nous visualisons simultanément les molécules de protéines individuelles et les condensats auxquels elles s’associent, utilisons le suivi des particules uniques (SPT) pour tracer les trajectoires d’une seule molécule, puis ajustons les trajectoires à un modèle de liaison protéine-gouttelette pour extraire la RT moyenne de la protéine. Enfin, nous montrons des résultats représentatifs où cette méthode d’imagerie à molécule unique a été appliquée pour comparer les RT moyens d’une protéine à ses condensats LLPS lorsqu’elle est fusionnée et non fusionnée à un domaine oligomérisant. Ce protocole est largement applicable à la mesure de la dynamique d’interaction de toute protéine qui participe à la LLPS.

Introduction

De plus en plus de travaux suggèrent que les condensats biomoléculaires jouent un rôle important dans l’organisation cellulaire et de nombreuses fonctions cellulaires, par exemple, la régulation transcriptionnelle 1,2,3,4,5, la réparation des dommages à l’ADN ^6,7,8, l’organisation de la chromatine 9,10,11,12, le chromosome X

Protocole

1. Marquage des protéines dans les cellules

1. Exprimer la protéine d’intérêt fusionnée à HaloTag dans la lignée cellulaire souhaitée.
2. Exprimer de manière stable H2B marqué Halo dans le même type de cellules que dans 1.1 en utilisant des transposons ou une transduction virale.

2. Préparation des lamelles

1. Avant d’utiliser des lamelles pour la culture cellulaire, nettoyez-les pour éliminer les contaminants autofluorescents.
   1. Montez les lamelles de 25 mm de diamètre, #1.5 sur un support de coloration en céramique et placez-les dans un récipient en polypropylène.

Discussion

Le protocole tel que présenté ici est conçu pour des systèmes tels que ceux étudiés dans Irgen-Gioro et ^al.40. Selon l’application, certains éléments du protocole peuvent être modifiés, par exemple, la méthode de génération de lignées cellulaires marquées par fluorescence, le système de marquage fluorescent et le style de lamelle utilisé. Le halomarquage d’une protéine dans une cellule peut être effectué à l’aide de deux stratégies, selon celle qui convient le mieux à .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips