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Résumé

Il a été démontré que de nombreuses protéines intrinsèquement désordonnées participent à la formation de condensats biomoléculaires hautement dynamiques, un comportement important pour de nombreux processus cellulaires. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie à molécule unique pour quantifier la dynamique par laquelle les protéines interagissent les unes avec les autres dans les condensats biomoléculaires des cellules vivantes.

Résumé

Les condensats biomoléculaires formés par séparation de phase liquide-liquide (LLPS) ont été considérés comme essentiels à l’organisation cellulaire et à un nombre croissant de fonctions cellulaires. La caractérisation des LLPS dans les cellules vivantes est également importante car la condensation aberrante a été liée à de nombreuses maladies, notamment les cancers et les troubles neurodégénératifs. La LLPS est souvent pilotée par des interactions sélectives, transitoires et multivalentes entre des protéines intrinsèquement désordonnées. La dynamique d’interaction des protéines participant aux LLPS est d’un grand intérêt, car elle est bien résumée par des mesures de leur temps de séjour de liaison (RT), c’est-à-dire le temps qu’elles passent lié dans les condensats. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie de cellules vivantes à molécule unique qui nous permet de mesurer la RT moyenne d’une protéine spécifique dans les condensats. Nous visualisons simultanément les molécules de protéines individuelles et les condensats auxquels elles s’associent, utilisons le suivi des particules uniques (SPT) pour tracer les trajectoires d’une seule molécule, puis ajustons les trajectoires à un modèle de liaison protéine-gouttelette pour extraire la RT moyenne de la protéine. Enfin, nous montrons des résultats représentatifs où cette méthode d’imagerie à molécule unique a été appliquée pour comparer les RT moyens d’une protéine à ses condensats LLPS lorsqu’elle est fusionnée et non fusionnée à un domaine oligomérisant. Ce protocole est largement applicable à la mesure de la dynamique d’interaction de toute protéine qui participe à la LLPS.

Introduction

De plus en plus de travaux suggèrent que les condensats biomoléculaires jouent un rôle important dans l’organisation cellulaire et de nombreuses fonctions cellulaires, par exemple, la régulation transcriptionnelle 1,2,3,4,5, la réparation des dommages à l’ADN 6,7,8, l’organisation de la chromatine 9,10,11,12, le chromosome X inactivation 13,14,15 et signalisation intracellulaire 16,17,18. De plus, la dérégulation des condensats biomoléculaires est impliquée dans de nombreuses maladies, notamment les cancers 19,20,21 et les troubles neurodégénératifs 22,23,24,25,26. La formation de condensats est souvent due à des interactions transitoires, sélectives et multivalentes protéine-protéine, protéine-acide nucléique ou acide nucléique-acide nucléique27. Dans certaines conditions, ces interactions peuvent conduire à une séparation de phase liquide-liquide (LLPS), une transition de densité qui enrichit localement des biomolécules spécifiques dans des gouttelettes sans membrane. De telles interactions multivalentes sont souvent médiées par les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) des protéines 1,28,29. La caractérisation biophysique de ces interactions au niveau moléculaire est essentielle à notre compréhension de nombreuses fonctions cellulaires saines et aberrantes, étant donné l’omniprésence des condensats à travers elles. Bien que les techniques basées sur la microscopie confocale à fluorescence, par exemple la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)30,31,32, aient été largement utilisées pour montrer qualitativement que les échanges moléculaires entre les condensats et l’environnement cellulaire environnant sont dynamiques, la quantification de la dynamique d’interaction de biomolécules spécifiques dans les condensats n’est généralement pas possible à l’aide de la microscopie confocale conventionnelle ou de la monomolécule microscopie sans méthodes d’analyse de données spécialisées. La technique de suivi des particules uniques (SPT) décrite dans ce protocole est basée sur la microscopie à molécule unique sur cellules vivantes33 et fournit un outil particulièrement puissant pour quantifier la dynamique d’interaction entre des protéines spécifiques dans les condensats. La lecture de SPT pour une telle mesure est le temps de séjour moyen d’une protéine d’intérêt dans les condensats.

Le protocole peut être décomposé en deux parties : l’acquisition et l’analyse des données. La première étape de l’acquisition de données d’imagerie consiste à exprimer dans les cellules une protéine d’intérêt qui est fusionnée à un HaloTag34. Cela permet de marquer la protéine d’intérêt avec deux fluorophores, où la majorité des molécules de protéines doivent être marquées avec un fluorophore non photoactivable (par exemple, JFX549 Haloligand 35) et une petite fraction d’entre elles doit être marquée avec un fluorophore photoactivable spectralement distinct (par exemple, PA-JF646 Haloligand 36). Cela permet l’acquisition simultanée de tous les emplacements des condensats dans la cellule et l’acquisition de films monomoléculaires de la protéine d’intérêt se liant et se dissociant aux condensats. Pendant ce temps, le même type de cellules est modifié pour exprimer de manière stable H2B marquée par Halo, une histone qui est en grande partie immobile sur la chromatine. Les cellules sont ensuite colorées avec le ligand PA-JF646 Halo pour permettre l’imagerie monomoléculaire de H2B. Comme nous le verrons en détail ci-dessous, cette expérience rend compte de l’apport du photoblanchiment pour permettre une quantification précise de la dynamique d’interaction de la protéine d’intérêt. Les cellules destinées aux expériences d’imagerie doivent ensuite être cultivées sur des lamelles propres, colorées avec un ou plusieurs ligands HaloTag et assemblées dans une chambre d’imagerie de cellules vivantes. À partir de là, l’échantillon est imagé sous un éclairage à feuille optique laminée et très inclinée (HILO) sur un microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) capable d’imagerie à deux canaux et de détection de molécules uniques. L’émission est ensuite divisée sur deux caméras, l’une suivant les positions des condensats et l’autre les molécules individuelles. L’acquisition est réalisée avec un temps d’intégration long (de l’ordre de centaines de ms) pour brouiller les protéines à diffusion libre et ne capturer que les protéines moins mobiles en raison de leur liaison à des structures stables dans la cellule37.

La première étape de l’analyse des données consiste à utiliser un algorithme de suivi des particules uniques (SPT)38,39 pour localiser les molécules de protéines individuelles dans chaque image du film et assembler les localisations en une trajectoire pour chaque molécule au cours de sa durée de vie détectable. Les trajectoires sont ensuite triées en celles représentant les molécules à l’intérieur et celles représentant les molécules à l’extérieur des condensats en comparant les localisations des molécules tout au long de leurs trajectoires aux localisations de tous les condensats aux temps correspondants1.

Ensuite, une courbe de survie (1 - CDF) est générée en utilisant les longueurs de toutes les trajectoires dans les condensats. Le temps de séjour moyen apparent des molécules est ensuite extrait en ajustant la courbe de survie au modèle exponentiel à deux composantes suivant de liaison aux protéines,

figure-introduction-6804,

avec A comme fraction de molécules non spécifiquement liées et avec kobs,ns et kobs,s comme taux de dissociation observés des molécules non spécifiquement liées et spécifiquement liées, respectivement. Seul kobs,s est considéré à partir de maintenant. La dynamique de la dissociation des protéines, ktrue,s, et du photoblanchiment du fluorophore, kpb, contribue à kobs,s comme

figure-introduction-7462;

ainsi, pour isoler les effets de la dissociation des protéines, le taux de dissociation spécifique de H2B-Halo dans la lignée cellulaire mentionnée précédemment est mesuré.

figure-introduction-7781

H2B est une protéine qui est intégrée de manière stable dans la chromatine et qui subit une dissociation minimale dans l’échelle de temps d’acquisition d’un film à molécule unique37. Son taux de dissociation spécifique est alors égal au taux de photoblanchiment du ligand PA-JF646 Halo, ou

figure-introduction-8240.

Le temps de séjour moyen dans le condensat de la protéine d’intérêt, figure-introduction-8427, est alors

figure-introduction-8555.

Les résultats représentatifs d’Irgen-Gioro et al.40 sont présentés, où ce protocole a été appliqué pour démontrer que la fusion d’un domaine d’oligomérisation à l’IDR entraîne des temps de séjour plus longs de l’IDR dans ses condensats. Ce résultat suggère que le domaine d’oligomérisation ajouté stabilise les interactions homotypiques de l’IDR qui pilote les LLPS. En principe, la même méthode avec des protocoles légèrement modifiés peut être appliquée pour caractériser les interactions homotypiques ou hétérotypiques de toute protéine qui participe à la formation de tout type de condensats.

Protocole

1. Marquage des protéines dans les cellules

  1. Exprimer la protéine d’intérêt fusionnée à HaloTag dans la lignée cellulaire souhaitée.
  2. Exprimer de manière stable H2B marqué Halo dans le même type de cellules que dans 1.1 en utilisant des transposons ou une transduction virale.

2. Préparation des lamelles

  1. Avant d’utiliser des lamelles pour la culture cellulaire, nettoyez-les pour éliminer les contaminants autofluorescents.
    1. Montez les lamelles de 25 mm de diamètre, #1.5 sur un support de coloration en céramique et placez-les dans un récipient en polypropylène.
    2. Immerger complètement les lamelles dans une solution de KOH à 1 M et de sonicate pendant 1 h.
    3. Rincer trois fois les lamelles avec de l’eau doublement distillée (jjdH2O).
    4. Immerger complètement les lamelles dans de l’éthanol à 100 % et du sonicate pendant 1 h.
    5. Immerger complètement les lamelles dans de l’éthanol à 20 % dilué avec du jdH2O et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.

3. Préparation des cellules pour la microscopie

REMARQUE : Effectuez les étapes de cette section dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination des cellules.

  1. Plaquez les cellules sur les lamelles nettoyées. Effectuer 2 jours avant l’imagerie si la protéine marquée Halo doit être exprimée transitoirement. Effectuer 1 jour avant l’imagerie si la protéine marquée Halo est exprimée de manière stable ou endogène.
    1. Utiliser une pince stérile pour placer les lamelles dans une plaque à 6 puits (une lamelle/puits par échantillon de cellule) et laisser l’éthanol résiduel s’évaporer.
    2. Plaquez chaque puits avec un nombre approprié de cellules pour atteindre une confluence de 70 % au moment de l’imagerie. Plaquez un puits supplémentaire avec des cellules exprimant de manière stable H2B-Halo avec la même confluence cible.
    3. Suivez cette étape uniquement si vous exprimez transitoirement la protéine d’intérêt marquée Halo. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2. Ensuite, transfectez les cellules avec le plasmide codant pour la protéine d’intérêt marquée à l’aide de réactifs de transfection appropriés et en suivant les directives du fabricant.
    4. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2.
  2. Colorer les cellules exprimant la protéine d’intérêt marquée Halo avec un ligand Halo non photoactivable (par exemple, JFX549) et un ligand Halo photoactivable (par exemple, PA-JF646). Cellules de coloration exprimant H2B-Halo avec uniquement le ligand photoactivable Halo.
    REMARQUE : Les concentrations de ligands Halo énumérées ici doivent être utilisées comme point de départ ; La concentration optimale dépendra du niveau d’expression et de la concentration locale dans le condensat de la protéine d’intérêt.
    1. Pour chaque échantillon cellulaire exprimant la protéine d’intérêt marquée Halo, diluer 100 nM JFX549 Haloligand 35 et 20 nM PA-JF646 Haloligand 36 dans 500 μL de milieu cellulaire approprié. Pour chaque échantillon exprimant H2B-Halo, diluer seulement 20 nM de ligand PA-JF646 Halo dans 500 μL de milieu cellulaire approprié.
    2. Pour chaque puits, aspirer les milieux existants, ajouter 2 mL de 1x PBS, puis aspirer le PBS (c’est ce qu’on appelle un « rinçage » pour le reste du protocole) et remplacer par des milieux contenant les ligands Halo appropriés.
    3. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
    4. Rincer avec du PBS quatre fois et remplacer par un milieu frais ne contenant pas de ligands Halo.
    5. Incuber pendant 15 min à 37 °C et 5% de CO2.
    6. Répéter les étapes 3.2.4 et 3.2.5 trois fois (quatre cycles de rinçage-incubation au total).
    7. Utilisez une pince stérile pour transférer la lamelle avec les cellules dans une chambre de lamelle de culture cellulaire compatible avec la platine du microscope.
    8. Ajouter un milieu sans rouge de phénol dans la chambre et procéder à l’imagerie. Incuber les échantillons sans les imager immédiatement à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

4. Imagerie monomoléculaire

REMARQUE : Des expériences indépendantes mesurant les temps de séjour de H2B et de la protéine d’intérêt doivent être menées sur plusieurs (≥3) jours pour générer des résultats statistiquement significatifs. Avant d’imager des échantillons de cellules au microscope, alignez les deux caméras à l’aide de microsphères colorées de 0,1 μm (Table des matériaux) ou d’un étalon d’étalonnage similaire.

  1. Préparez le microscope.
    1. Allumez le microscope et l’ordinateur qui le contrôle.
    2. Allumez les composants d’incubation des cellules vivantes (chauffage et CO2) sur le microscope et réglez-le à 37 °C et 5 % de CO2. Laissez le système s’équilibrer.
    3. Mettez une goutte d’huile appropriée sur un objectif à immersion dans l’huile TIRF 100x sur le microscope et chargez l’échantillon de cellule sur la platine du microscope.
  2. Identifiez une cellule à imager.
    1. Imagez l’échantillon de cellule sous un éclairage en fond clair et ajustez la position z jusqu’à ce que les cellules soient nettes.
    2. Identifier une cellule qui présente les caractéristiques morphologiques des cellules saines.
    3. Recadrez le champ de vision (FOV) afin qu’il ne capture que le noyau de la cellule cible.
    4. Utilisez l’éclairage laser et ajustez l’angle TIRF jusqu’à ce que l’éclairage HILO41 avec un rapport signal/bruit optimal des molécules individuelles soit atteint.
  3. Image H2B-Halo dans des cellules vivantes.
    REMARQUE : Les puissances laser utilisées dans cette section sont spécifiques à cette expérience et incluses à titre d’exemple. Les puissances laser appropriées doivent être choisies en fonction des critères énumérés dans la discussion.
    1. Configurez une configuration d’acquisition comme suit. Réglez le temps d’exposition sur 500 ms. Au cours de chaque exposition de 500 ms, excitez les molécules H2B-Halo marquées PA-JF646 avec un faisceau de 9,1 mW, 640 nm. Pendant le temps mort entre les images (158,01 μs sur le système d’imagerie utilisé ici), photoactivez les molécules avec un faisceau de 111 μW, 405 nm.
    2. Capturez 2000 images en continu avec ces paramètres. Augmenter progressivement la puissance du faisceau de 405 nm au cours de l’acquisition lorsque le nombre de molécules photoactivées devient insuffisant.
  4. Imagez la protéine d’intérêt marquée Halo dans les cellules vivantes.
    1. Utilisez un miroir dichroïque passe-long pour répartir les longueurs d’onde d’émission entre deux caméras, l’une pour détecter PA-JF646 et l’autre pour détecter JFX549. Utilisez des filtres d’émission appropriés devant les caméras.
    2. Utilisez la même configuration d’acquisition décrite dans la version 4.3.1 avec la modification suivante. Ajoutez un canal JFX549 supplémentaire pour suivre l’emplacement des condensats de protéines marqués Halo au fil du temps. Toutes les 10 s, acquérir une trame (500 ms, 2,1 mW, excitation 561 nm) dans le canal JFX549 tout en conservant l’acquisition du canal PA-JF646. Cela provoquera un saignement dans le canal PA-JF646, qui sera pris en charge dans l’analyse des données post-acquisition.
    3. Capturez 2000 images en continu avec ces paramètres. Augmenter progressivement la puissance du faisceau de 405 nm au cours de l’acquisition lorsque le nombre de molécules photoactivées devient insuffisant.

5. Analyse des données d’imagerie de molécules uniques

REMARQUE : Les paramètres utilisés dans la section 5 sont spécifiques à cette expérience et inclus à titre d’exemple. Les paramètres appropriés doivent être choisis en fonction des critères énumérés dans la discussion.

  1. Préparez les données d’imagerie brutes pour le traitement.
    1. Pour les données de la protéine d’intérêt, convertissez chaque canal du fichier de données d’imagerie brutes en un fichier .tif indépendant à l’aide d’ImageJ ou d’un logiciel de traitement d’image similaire. Pour les données de H2B, convertissez le canal unique du fichier de données d’imagerie brutes en un fichier .tif de la même manière.
      REMARQUE : Selon le logiciel d’acquisition utilisé, il peut y avoir des images vides dans le film condensat, car une seule image de suivi des condensats est prise toutes les 10 s. Les images vides doivent être remplies avec la trame condensée la plus récente (certains logiciels d’acquisition le font automatiquement). De plus, s’il y a un écoulement important du canal de condensat (JFX549) vers le canal de monomolécule (PA-JF646) pendant ces trames de suivi de condensat, les trames de monomolécule correspondantes doivent être remplacées par la trame de monomolécule la plus récente.
    2. Si des images doivent être remplacées dans l’une ou l’autre des séquences pour les raisons ci-dessus, remplacez-les par l’image la plus récente de cette séquence en modifiant (si nécessaire) et en exécutant pretracking_comb.txt, une macro ImageJ disponible dans Chong et al.1, et en suivant les invites.
  2. Générer des trajectoires de particules uniques à l’aide d’un logiciel SPT, par exemple SLIMfast39, une implémentation graphique de l’algorithme MTT38 disponible dans Teves et al.42.
    1. Chargez le fichier de la version 5.1.2 contenant le film monomolécule dans SLIMfast en cliquant sur Charger > Imagestack.
    2. Définissez les paramètres (taux d’erreur de localisation : 10-6 ; boucles de déflation : 3) pour la localisation en cliquant sur OPT > Feuille : Localisation.
    3. Définissez les paramètres (pic d’émission : 664 nm ; temps de latence : 500 ms) pour l’acquisition en cliquant sur OPT > Feuille : Acquisition.
    4. Visualisez les localisations de toutes les molécules dans un seul cadre pour vous assurer que les paramètres choisis sont appropriés (TEST LOC). Si cela n’est pas approprié, modifiez les paramètres aux étapes 5.2.2 et 5.2.3 et répétez cette étape.
    5. Générez un fichier contenant les localisations de toutes les molécules dans chaque image (LOC ALL).
    6. Chargez le fichier à partir de la version 5.2.5 dans SLIMfast en cliquant sur Charger > données de particules > SLIMfast.
    7. Définissez les paramètres (coefficient de diffusion maximal attendu : 0,1 μm2/s ; nombre maximum de concurrents : 5) pour la génération de trajectoires en cliquant sur OPT > Feuille : Suivi.
    8. Générer un fichier contenant les trajectoires de toutes les molécules (GEN TRAJ).
  3. Filtrer les trajectoires plus courtes que tmin, 2,5 s, à l’aide de evalSPT39, disponible dans Drosopoulos et al.43, pour tenir compte des erreurs de suivi qui entraînent des trajectoires artificiellement courtes.
    1. Chargez le fichier de la version 5.2.8 dans evalSPT (+ fichier > de la version 5.2.8 > OK).
    2. Définissez les paramètres (min : 5 images ; max : longueur maximale de la trajectoire pour le fichier à partir de la version 5.2.8) pour filtrer les trajectoires inférieures à 2,5 s.
    3. Générez un fichier avec toutes les trajectoires filtrées (EXPORTER LES DONNÉES).
  4. Suivez cette étape pour les trajectoires de la protéine d’intérêt uniquement. Triez les trajectoires entre celles dans les condensats et celles hors des condensats, puis extrayez le temps moyen de séjour dans les condensats.
    REMARQUE : Tous les codes de cette section sont disponibles dans Chong et al.1.
    1. Seuilz toutes les images de la vidéo acquises dans le canal JFX549 pour générer une vidéo time-lapse remplie du masque binaire évolutif dans le temps mettant en évidence les emplacements des condensats en exécutant les mask_v2.txt macro, noyau et cluster ImageJ et en suivant les invites.
    2. Reformater les trajectoires d’une seule molécule générées en 5.3.3. en utilisant le script MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, et en ajustant les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire. (Paramètres : exposition, 0,5 s ; Résolution, 0,16 μm/pixel).
    3. Triez les trajectoires en fonction de la fraction de la durée de vie d’une molécule donnée dans un condensat, F, à l’aide du script MATLAB, categorization_v4.m, et ajustez les noms de fichiers et les chemins si nécessaire.
    4. Procédez en utilisant uniquement des trajectoires dans les condensats.
  5. Extraire kobs,s et kpb et calculer le temps de séjour moyen corrigé, figure-protocol-13746.
    1. Extrayez kobs,s des trajectoires de la protéine dans le condensat d’intérêt à l’aide du script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, et en ajustant les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire.
      (Paramètres : exposition, 0,5 s ; StartFrameForFit, 5 images).
    2. Extrayez kpb des trajectoires H2B à l’aide du script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, et ajustez les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire.
      (Paramètres : exposition, 0,5 s ; StartFrameForFit, 5 images).
    3. Calculer le temps de séjour moyen corrigé de la protéine d’intérêt spécifiquement liée à ses condensats, figure-protocol-14620comme ,
      figure-protocol-14719
      REMARQUE : Des contrôles doivent être effectués pour vérifier que différents temps d’exposition suffisamment longs pour brouiller les particules mobiles, par exemple 300 ms et 800 ms, entraînent toujours le même temps de séjour moyen de la protéine d’intérêt.

Résultats

Nous présentons ici les résultats représentatifs d’Irgen-Gioro et al.40, où nous avons utilisé ce protocole SPT pour comparer la dynamique d’interaction de deux protéines dans leurs condensats LLPS auto-assemblés respectifs. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contient un IDR qui peut subir une LLPS en cas de surexpression dans les cellules humaines. Nous avons émis l’hypothèse que la fusion de TAF15(IDR) à FTH1 (ferritine lourde 1), qui forme un oligomère à 24 ...

Discussion

Le protocole tel que présenté ici est conçu pour des systèmes tels que ceux étudiés dans Irgen-Gioro et al.40. Selon l’application, certains éléments du protocole peuvent être modifiés, par exemple, la méthode de génération de lignées cellulaires marquées par fluorescence, le système de marquage fluorescent et le style de lamelle utilisé. Le halomarquage d’une protéine dans une cellule peut être effectué à l’aide de deux stratégies, selon celle qui convient le mieux à ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la bourse de recherche de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), la subvention de recherche de la Fondation Shurl et Kay Curci (S.C.), la subvention Merkin Innovation Seed (S.C.), la subvention de recherche Mallinckrodt (S.C.) et la bourse Margaret E. Subvention Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. est également soutenu par le NIH/NCI sous le numéro de bourse P30CA016042.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

Références

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