Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Riepilogo

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Abstract

I condensati biomolecolari formati tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS) sono stati considerati critici nell'organizzazione cellulare e in un numero crescente di funzioni cellulari. La caratterizzazione delle LLPS nelle cellule vive è importante anche perché la condensazione aberrante è stata collegata a numerose malattie, tra cui tumori e disturbi neurodegenerativi. La LLPS è spesso guidata da interazioni selettive, transitorie e multivalenti tra proteine intrinsecamente disordinate. Di grande interesse sono le dinamiche di interazione delle proteine che partecipano alle LLPS, che sono ben riassunte dalle misurazioni del loro tempo di residenza di legame (RT), cioè la quantità di tempo che trascorrono legate all'interno dei condensati. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging di singole molecole di cellule vive che ci consente di misurare la RT media di una specifica proteina all'interno dei condensati. Visualizziamo simultaneamente le singole molecole proteiche e i condensati a cui si associano, utilizziamo il tracciamento di singole particelle (SPT) per tracciare le traiettorie delle singole molecole e quindi adattiamo le traiettorie a un modello di legame proteina-gocciolina per estrarre l'RT medio della proteina. Infine, mostriamo risultati rappresentativi in cui questo metodo di imaging a singola molecola è stato applicato per confrontare gli RT medi di una proteina nei suoi condensati LLPS quando fusa e non fusa in un dominio oligomerizzante. Questo protocollo è ampiamente applicabile alla misurazione delle dinamiche di interazione di qualsiasi proteina che partecipa alle LLPS.

Introduzione

Un numero crescente di lavori suggerisce che i condensati biomolecolari svolgono un ruolo importante nell'organizzazione cellulare e in numerose funzioni cellulari, ad esempio la regolazione trascrizionale 1,2,3,4,5, la riparazione del danno al DNA ^6,7,8, l'organizzazione della cromatina 9,10,11,12, il cromosoma X

Protocollo

1. Marcatura delle proteine nelle cellule

1. Esprimere la proteina di interesse fusa con HaloTag nella linea cellulare desiderata.
2. Esprime stabilmente H2B con tag alogeno nello stesso tipo di cellule di cui alla versione 1.1 utilizzando trasposoni o trasduzione virale.

2. Preparazione dei vetrini coprioggetti

1. Prima di utilizzare i vetrini coprioggetti per la coltura cellulare, pulire i vetrini coprioggetti per rimuovere i contaminanti autofluorescenti.
   1. Montare vetrini coprioggetti #1,5 di diametro 25 mm su un rack per colorazione in ceramica e inserirli in un contenit....

Discussione

Il protocollo qui presentato è progettato per sistemi come quelli studiati in Irgen-Gioro et ^al.40. A seconda dell'applicazione, alcuni componenti del protocollo possono essere modificati, ad esempio il metodo per generare linee cellulari marcate con fluorescenza, il sistema di marcatura fluorescente e lo stile di vetrino coprioggetto utilizzato. L'halo-tagging di una proteina in una cellula può essere fatto usando due strategie, a seconda di quale sia più adatta per un determinato esperimento........

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips