Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Zusammenfassung

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Zusammenfassung

Biomolekulare Kondensate, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) gebildet werden, gelten als entscheidend für die zelluläre Organisation und eine zunehmende Anzahl zellulärer Funktionen. Die Charakterisierung von LLPS in lebenden Zellen ist auch deshalb wichtig, weil aberrante Kondensation mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde, darunter Krebs und neurodegenerative Erkrankungen. LLPS wird oft durch selektive, transiente und multivalente Wechselwirkungen zwischen intrinsisch ungeordneten Proteinen angetrieben. Von großem Interesse ist die Interaktionsdynamik von Proteinen, die an LLPS beteiligt sind, die durch Messungen ihrer Bindungsverweilzeit (RT), d.h. der Zeit, die sie in Kondensaten gebunden verbringen, gut zusammengefasst wird. Hier stellen wir eine Methode vor, die auf der Einzelmolekül-Bildgebung lebender Zellen basiert und es uns ermöglicht, die mittlere RT eines bestimmten Proteins in Kondensaten zu messen. Wir visualisieren gleichzeitig einzelne Proteinmoleküle und die Kondensate, mit denen sie assoziiert sind, verwenden Single-Particle Tracking (SPT), um Einzelmolekül-Trajektorien aufzuzeichnen, und passen die Trajektorien dann an ein Modell der Protein-Tröpfchen-Bindung an, um die mittlere RT des Proteins zu extrahieren. Schließlich zeigen wir repräsentative Ergebnisse, bei denen diese Einzelmolekül-Bildgebungsmethode angewendet wurde, um die mittleren RTs eines Proteins an seinen LLPS-Kondensaten zu vergleichen, wenn es mit einer oligomerisierenden Domäne fusioniert und nicht fusioniert ist. Dieses Protokoll ist allgemein anwendbar auf die Messung der Interaktionsdynamik jedes Proteins, das an LLPS beteiligt ist.

Einleitung

Eine wachsende Zahl von Arbeiten deutet darauf hin, dass biomolekulare Kondensate eine wichtige Rolle bei der zellulären Organisation und zahlreichen zellulären Funktionen spielen, z. B. Transkriptionsregulation 1,2,3,4,5, DNA-Schadensreparatur ^6,7,8, Chromatinorganisation ^9,10,11,12, X-Chromosom

Protokoll

1. Markierung von Proteinen in Zellen

1. Exprimieren Sie das Protein von Interesse, das mit HaloTag fusioniert ist, in der gewünschten Zelllinie.
2. Stabiles exprimieren Halo-markiertes H2B im gleichen Zelltyp wie in 1.1 unter Verwendung von Transposons oder viraler Transduktion.

2. Vorbereitung von Deckgläsern

1. Reinigen Sie vor der Verwendung von Deckgläsern für die Zellkultur die Deckgläser, um autofluoreszierende Verunreinigungen zu entfernen.
   1. Montieren Sie die Deckgläser #1,5 mit einem Durchmesser von 25 mm auf einem Keramikfärbegestell und legen Sie sie in einen Poly....

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll ist für Systeme wie die in Irgen-Gioro et ^al.40 untersuchten konzipiert. Je nach Anwendung können einige Komponenten des Protokolls modifiziert werden, z. B. das Verfahren zur Erzeugung fluoreszenzmarkierter Zelllinien, das fluoreszierende Markierungssystem und die Art des verwendeten Deckglases. Das Halo-Tagging eines Proteins in einer Zelle kann mit zwei Strategien erfolgen, je nachdem, welche für ein bestimmtes Experiment besser geeignet ist. 1) Exogene Expres.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips