Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Sıvı-sıvı faz ayrımı (LLPS) yoluyla oluşan biyomoleküler kondensatlar, hücresel organizasyonda ve artan sayıda hücresel fonksiyonda kritik olarak kabul edilmiştir. Canlı hücrelerde LLPS'yi karakterize etmek de önemlidir, çünkü anormal yoğunlaşma, kanserler ve nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere çok sayıda hastalıkla ilişkilendirilmiştir. LLPS genellikle içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki seçici, geçici ve çok değerlikli etkileşimler tarafından yönlendirilir. LLPS'ye katılan proteinlerin etkileşim dinamikleri büyük ilgi çekicidir ve bunlar, bağlanma kalma sürelerinin (RT), yani kondensatlar içinde bağlı olarak geçirdikleri sürenin ölçümleriyle iyi bir şekilde özetlenmiştir. Burada, kondensatlar içindeki belirli bir proteinin ortalama RT'sini ölçmemizi sağlayan canlı hücreli tek moleküllü görüntülemeye dayalı bir yöntem sunuyoruz. Tek tek protein moleküllerini ve ilişkili oldukları kondensatları aynı anda görselleştiriyoruz, tek moleküllü yörüngeleri çizmek için tek parçacık izleme (SPT) kullanıyoruz ve ardından proteinin ortalama RT'sini çıkarmak için yörüngeleri bir protein damlacık bağlama modeline uyarlıyoruz. Son olarak, bu tek moleküllü görüntüleme yönteminin, bir oligomerleştirici alana kaynaştığında ve kaynaşmadığında LLPS kondensatlarındaki bir proteinin ortalama RT'lerini karşılaştırmak için uygulandığı temsili sonuçları gösteriyoruz. Bu protokol, LLPS'ye katılan herhangi bir proteinin etkileşim dinamiklerini ölçmek için geniş çapta uygulanabilir.

Giriş

Giderek artan sayıda çalışma, biyomoleküler kondensatların hücresel organizasyonda ve çok sayıda hücresel fonksiyonda önemli bir rol oynadığını göstermektedir, örneğin, transkripsiyonel düzenleme 1,2,3,4,5, DNA hasar onarımı 6,7,8, kromatin organizasyonu 9,10,11,12, X-kromozomu inaktivasyon 13,14,15 ve hücre içi sinyal 16,17,18. Ek olarak, biyomoleküler kondensatların düzensizliği, kanserler 19,20,21 ve nörodejeneratif bozukluklar 22,23,24,25,26 dahil olmak üzere birçok hastalıkta rol oynar. Kondens oluşumu genellikle geçici, seçici ve çok değerlikli protein-protein, protein-nükleik asit veya nükleik asit-nükleik asit etkileşimleri tarafından yönlendirilir27. Belirli koşullar altında, bu etkileşimler, zarsız damlacıklardaki spesifik biyomolekülleri yerel olarak zenginleştiren bir yoğunluk geçişi olan sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) yol açabilir. Bu tür çok değerlikli etkileşimlere genellikle proteinlerin içsel olarak düzensiz bölgeleri (IDR'ler)aracılık eder 1,28,29. Bu etkileşimlerin moleküler düzeyde biyofiziksel karakterizasyonu, kondensatların bunlar arasındaki yaygınlığı göz önüne alındığında, çok sayıda sağlıklı ve anormal hücresel fonksiyonu anlamamız için kritik öneme sahiptir. Konfokal floresan mikroskobuna dayalı teknikler, örneğin fotoağartma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP)30,31,32, kondensatlar ve çevredeki hücresel ortam arasındaki moleküler değişimlerin dinamik olduğunu kalitatif olarak göstermek için yaygın olarak kullanılmış olsa da, kondensatlar içindeki spesifik biyomoleküllerin etkileşim dinamiklerini ölçmek genellikle geleneksel konfokal mikroskopi veya tek molekül kullanılarak mümkün değildir özel veri analizi yöntemleri olmadan mikroskopi. Bu protokolde açıklanan tek parçacık izleme (SPT) tekniği, canlı hücreli tek moleküllü mikroskopiye33 dayanır ve kondensatlar içindeki spesifik proteinler arasındaki etkileşim dinamiklerini ölçmek için benzersiz derecede güçlü bir araç sağlar. Bu tür bir ölçüm için SPT'nin okunması, ilgilenilen bir proteinin kondensatlarda ortalama kalma süresidir.

Protokol iki bölüme ayrılabilir - veri toplama ve veri analizi. Görüntüleme verilerinin toplanmasının ilk adımı, hücrelerde bir HaloTag34 ile kaynaşmış bir proteini ifade etmektir. Bu, ilgilenilen proteinin, protein moleküllerinin çoğunluğunun fotoaktif olmayan bir florofor (örneğin, JFX549 Halo ligand35) ile etiketleneceği ve bunların küçük bir kısmının spektral olarak farklı, fotoaktif bir florofor ile etiketleneceği iki florofor ile etiketlenmesini sağlar (örneğin, PA-JF646 Halo ligand36). Bu, hücredeki tüm kondensat konumlarının aynı anda elde edilmesine ve kondensatlara bağlanan ve bağlanmayan ilgilenilen proteinin tek moleküllü filmlerinin elde edilmesine izin verir. Bu arada, aynı tip hücreler, kromatin üzerinde büyük ölçüde hareketsiz olan bir histon olan Halo etiketli H2B'yi kararlı bir şekilde eksprese etmek için modifiye edilir. Hücreler daha sonra H2B'nin tek moleküllü görüntülenmesini sağlamak için PA-JF646 Halo ligandı ile boyanır. Aşağıda ayrıntılı olarak tartışılacağı gibi, bu deney, ilgilenilen proteinin etkileşim dinamiklerinin kesin olarak ölçülmesini sağlamak için foto ağartmanın katkısını açıklar. Görüntüleme deneyleri için hücreler daha sonra temiz lameller üzerinde kültürlenmeli, HaloTag ligand(lar)ı ile boyanmalı ve canlı hücre görüntüleme odasına monte edilmelidir. Oradan, numune, iki kanallı görüntüleme ve tek molekül algılama yeteneğine sahip bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu üzerinde oldukça eğimli ve lamine optik levha (HILO) aydınlatması altında görüntülenir. Emisyon daha sonra iki kameraya bölünür, biri kondensat konumlarını izler ve diğeri tek molekülleri izler. Edinim, serbestçe yayılan proteinleri bulanıklaştırmak ve yalnızca hücredeki kararlı yapılara bağlanma nedeniyle daha az hareketli olan proteinleri yakalamak için uzun bir entegrasyon süresiyle (yüzlerce ms mertebesinde) gerçekleştirilir37.

Veri analizinin ilk adımı, filmin her karesinde tek tek protein moleküllerini lokalize etmek ve lokalizasyonları tespit edilebilir ömrü boyunca her molekül için bir yörüngede birleştirmek için yerleşik bir tek parçacık izleme (SPT) algoritması38,39 kullanmaktır. Yörüngeler daha sonra, moleküllerin yörüngeleri boyunca lokalizasyonlarını, karşılık gelen zamanlarda tüm kondensatların lokalizasyonlarıyla karşılaştırarak, kondensatların içindeki molekülleri temsil edenler ve kondensatların dışındaki molekülleri temsil edenler olarak sıralanır1.

Daha sonra, tüm yoğuşma yörüngelerinin uzunlukları kullanılarak bir hayatta kalma eğrisi (1 - CDF) oluşturulur. Moleküllerin görünen ortalama kalış süresi daha sonra hayatta kalma eğrisinin aşağıdaki iki bileşenli üstel protein bağlanma modeline uydurulmasıyla çıkarılır,

figure-introduction-6136,

spesifik olarak bağlı olmayan moleküllerin fraksiyonu olarak A ile ve sırasıyla spesifik olarak bağlı olmayan ve spesifik olarak bağlı moleküllerin gözlenen ayrışma oranları olarak kobs,ns ve kobs,s ile. Buradan sonra sadece kobs,s dikkate alınır. Hem protein ayrışmasının dinamikleri, ktrue,s, hem de floroforun fotoağartılması, kpb, kobs,s

figure-introduction-6759;

bu nedenle, protein ayrışmasının etkilerini izole etmek için, daha önce bahsedilen hücre hattındaki H2B-Halo'nun spesifik ayrışma hızı ölçülür.

figure-introduction-7049

H2B, kromatine kararlı bir şekilde entegre edilmiş ve tek moleküllü bir film ediniminin zaman ölçeğinde minimum ayrışma yaşayan bir proteindir37. Spesifik ayrışma hızı daha sonra PA-JF646 Halo ligandının fotoağartma hızına eşittir veya

figure-introduction-7454.

İlgilenilen proteinin ortalama kondensat içinde kalma süresi, figure-introduction-7634, o zaman

figure-introduction-7760.

Irgen-Gioro ve ark.40'tan elde edilen temsili sonuçlar, bir oligomerizasyon alanının IDR'ye kaynaştırılmasının IDR'nin kondensatlarında daha uzun kalma sürelerine yol açtığını göstermek için bu protokolün uygulandığı gösterilmiştir. Bu sonuç, eklenen oligomerizasyon alanının, LLPS'yi yönlendiren IDR'nin homotipik etkileşimlerini stabilize ettiğini göstermektedir. Prensip olarak, herhangi bir kondensat oluşumuna katılan herhangi bir proteinin homotipik veya heterotipik etkileşimlerini karakterize etmek için hafifçe değiştirilmiş protokollerle aynı yöntem uygulanabilir.

Protokol

1. Hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi

  1. İstenilen hücre hattında HaloTag ile kaynaşmış ilgilenilen proteini ifade edin.
  2. Halo etiketli H2B'yi, transpozonlar veya viral transdüksiyon kullanarak 1.1'deki ile aynı tip hücrelerde kararlı bir şekilde eksprese edin.

2. Lamellerin hazırlanması

  1. Hücre kültürü için lamelleri kullanmadan önce, otofloresan kirleticileri gidermek için lamelleri temizleyin.
    1. 25 mm çapında, #1.5 lameller seramik bir boyama rafına monte edin ve bir polipropilen kaba yerleştirin.
    2. Lamelleri 1 M'lik bir KOH çözeltisine tamamen daldırın ve 1 saat boyunca sonikleştirin.
    3. Lamelleri çift damıtılmış su (ddH2O) ile üç kez durulayın.
    4. Lamelleri tamamen% 100 etanole daldırın ve 1 saat boyunca sonikat yapın.
    5. Lamelleri ddH2O ile seyreltilmiş %20 etanole tamamen daldırın ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.

3. Mikroskopi için hücrelerin hazırlanması

NOT: Hücrelerin kirlenmesini önlemek için bu bölümdeki adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

  1. Temizlenmiş lameller üzerindeki plaka hücreleri. Halo etiketli proteinin geçici olarak eksprese edilmesi gerekiyorsa görüntülemeden 2 gün önce gerçekleştirin. Halo etiketli proteinin stabil veya endojen olarak eksprese edilip edilmediğini görüntülemeden 1 gün önce gerçekleştirin.
    1. Lamelleri 6 oyuklu bir plakaya (hücre numunesi başına bir lamel/kuyucuk) yerleştirmek için steril forseps kullanın ve artık etanolün buharlaşmasına izin verin.
    2. Görüntüleme sırasında% 70 birleşme elde etmek için her bir kuyucuğu uygun sayıda hücre ile kaplayın. Aynı hedef birleşme ile H2B-Halo'yu stabil bir şekilde eksprese eden hücrelerle ek bir kuyu kaplayın.
    3. Bu adımı, yalnızca ilgilenilen Halo etiketli proteini geçici olarak ifade ediyorsanız izleyin. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin. Daha sonra, uygun transfeksiyon reaktiflerini kullanarak ve üreticinin yönergelerini izleyerek, ilgilenilen etiketli proteini kodlayan plazmid ile hücreleri transfekte edin.
    4. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.
  2. İlgilenilen Halo etiketli proteini eksprese eden hücreleri, hem fotoaktif olmayan bir Halo ligandı (örneğin, JFX549) hem de fotoaktif hale getirilebilir bir Halo ligandı (örneğin, PA-JF646) ile boyayın. Sadece fotoaktive olabilen Halo ligandı ile H2B-Halo eksprese eden hücreleri boyayın.
    NOT: Burada listelenen Halo ligandlarının konsantrasyonları bir başlangıç noktası olarak kullanılmalıdır; Optimal konsantrasyon, ilgilenilen proteinin ekspresyon seviyesine ve kondensat içi lokal konsantrasyonuna bağlı olacaktır.
    1. İlgilenilen Halo etiketli proteini eksprese eden her hücre örneği için, 100 μL uygun hücre ortamında 100 nM JFX549 Halo ligand35 ve 20 nM PA-JF646 Halo ligand36'yı seyreltin. H2B-Halo eksprese eden her numune için, 500 μL uygun hücre ortamında sadece 20 nM PA-JF646 Halo ligandını seyreltin.
    2. Her kuyucuk için mevcut ortamı aspire edin, 2 mL 1x PBS ekleyin, ardından PBS'yi aspire edin (bu, protokolün geri kalanı için "durulama" olarak adlandırılır) ve uygun Halo ligandlarını içeren ortamla değiştirin.
    3. 37 °C ve% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.
    4. PBS ile dört kez durulayın ve Halo ligandları içermeyen taze ortamla değiştirin.
    5. 37 °C ve% 5 CO2'de 15 dakika inkübe edin.
    6. 3.2.4 ve 3.2.5 adımlarını üç kez tekrarlayın (toplam dört durulama-inkübasyon döngüsü).
    7. Hücrelerle birlikte lameli mikroskop aşamasıyla uyumlu bir hücre kültürü lamel odasına aktarmak için steril forseps kullanın.
    8. Hazneye fenol kırmızısı içermeyen ortam ekleyin ve görüntülemeye devam edin. İhtiyaç duyulana kadar 37 °C ve% 5 CO2 'de hemen görüntülenmeyen numuneleri inkübe edin.

4. Tek moleküllü görüntüleme

NOT: Hem H2B'nin hem de ilgilenilen proteinin kalma sürelerini ölçen bağımsız deneyler, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için birden fazla (≥3) gün boyunca yapılmalıdır. Hücre örneklerini mikroskopta görüntülemeden önce, iki kamerayı 0,1 μm lekeli mikro küreler (Malzeme Tablosu) veya benzer bir kalibrasyon standardı kullanarak hizalayın.

  1. Mikroskobu hazırlayın.
    1. Mikroskobu ve mikroskobu kontrol eden bilgisayarı açın.
    2. Mikroskopta canlı hücre inkübasyon bileşenlerini (ısıtıcı ve CO2) açın ve 37 ° C ve% 5 CO2 'ye ayarlayın. Sistemin dengelenmesine izin verin.
    3. Mikroskop üzerinde 100x TIRF yağa daldırma objektifine uygun yağdan bir damla damlatın ve hücre örneğini mikroskop aşamasına yükleyin.
  2. Görüntülenecek bir hücreyi tanımlayın.
    1. Hücre örneğini parlak alan aydınlatması altında görüntüleyin ve hücreler odaklanana kadar z konumunu ayarlayın.
    2. Sağlıklı hücrelerin morfoloji özelliklerini sergileyen bir hücreyi tanımlayın.
    3. Görüş alanını (FOV) yalnızca hedef hücre çekirdeğini yakalayacak şekilde kırpın.
    4. Lazer aydınlatmayı kullanın ve tek moleküllerin optimum sinyal-gürültü oranına sahip HILO aydınlatması41 elde edilene kadar TIRF açısını ayarlayın.
  3. Canlı hücrelerde H2B-Halo görüntüsü.
    NOT: Bu bölümde kullanılan lazer güçleri bu deneye özeldir ve örnek olarak dahil edilmiştir. Tartışmada listelenen kriterlere göre uygun lazer güçleri seçilmelidir.
    1. Aşağıdaki gibi bir alım yapılandırması ayarlayın. Pozlama süresini 500 ms olarak ayarlayın. Her 500 ms maruziyet sırasında, PA-JF646 etiketli H2B-Halo moleküllerini 9.1 mW, 640 nm ışınla uyarın. Çerçeveler arasındaki ölü zamanda (burada kullanılan görüntüleme sisteminde 158.01 μs), molekülleri 111 μW, 405 nm ışınla fotoaktive eder.
    2. Bu ayarlar altında sürekli olarak 2000 kare yakalayın. Fotoaktif moleküllerin sayısı yetersiz hale geldiğinde, edinme boyunca 405 nm ışının gücünü kademeli olarak artırın.
  4. Canlı hücrelerde ilgilenilen Halo etiketli proteini görüntüleyin.
    1. Emisyon dalga boylarını iki kamera arasında bölmek için uzun geçişli bir dikroik ayna kullanın, biri PA-JF646'yı ve diğeri JFX549'u algılamak için. Kameraların önünde uygun emisyon filtreleri kullanın.
    2. Aşağıdaki değişiklikle 4.3.1'de açıklanan aynı alma yapılandırmasını kullanın. Halo etiketli protein kondensatlarının zaman içindeki konumlarını izlemek için ek bir JFX549 kanalı ekleyin. Her 10 saniyede bir, PA-JF646 kanalının alımını korurken JFX549 kanalında bir kare (500 ms, 2,1 mW, 561 nm uyarma) elde edin. Bu, satın alma sonrası veri analizinde halledilecek olan PA-JF646 kanalına sızıntıya neden olacaktır.
    3. Bu ayarlar altında sürekli olarak 2000 kare yakalayın. Fotoaktif moleküllerin sayısı yetersiz hale geldiğinde, edinme boyunca 405 nm ışının gücünü kademeli olarak artırın.

5. Tek moleküllü görüntüleme verilerinin analizi

NOT: Bölüm 5 boyunca kullanılan parametreler bu deneye özeldir ve örnek olarak dahil edilmiştir. Tartışmada listelenen kriterlere göre uygun parametreler seçilmelidir.

  1. Ham görüntüleme verilerini işlenmek üzere hazırlayın.
    1. İlgilenilen proteinin verileri için, ham görüntüleme veri dosyasındaki her kanalı ImageJ veya benzeri bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bağımsız bir .tif dosyasına dönüştürün. H2B verileri için, ham görüntüleme veri dosyasındaki tek kanalı aynı şekilde bir .tif dosyasına dönüştürün.
      NOT: Kullanılan toplama yazılımına bağlı olarak, her 10 saniyede bir yalnızca bir yoğuşma izleme karesi alındığından, yoğuşma filminde boş kareler olabilir. Boş çerçeveler en son yoğuşma çerçevesi ile doldurulmalıdır (bazı toplama yazılımları bunu otomatik olarak yapar). Ek olarak, bu yoğuşma izleme çerçeveleri sırasında yoğuşma (JFX549) kanalından tek moleküllü (PA-JF646) kanala önemli bir sızıntı varsa, karşılık gelen tek moleküllü çerçeveler en son tek moleküllü çerçeve ile değiştirilmelidir.
    2. Yukarıdaki nedenlerden dolayı her iki filmde de değiştirilmesi gereken kareler varsa, Chong ve ark.1'de bulunan bir ImageJ makrosu olan pretracking_comb.txt'yi değiştirerek (gerekirse) ve çalıştırarak ve istemleri izleyerek bunları o filmden en son kareyle değiştirin.
  2. Bir SPT yazılımı kullanarak tek parçacıklı yörüngeler oluşturun, örneğin, SLIMfast39, Teves ve ark.42'de bulunan MTT algoritmasının38 bir GUI uygulaması.
    1. Tek moleküllü filmi içeren dosyayı 5.1.2'den SLIMfast'> Yükle'ye tıklayarak yükleyin.
    2. Parametreleri ayarlayın (yerelleştirme hata oranı: 10-6; deflasyon döngüleri: 3) OPT > Sayfa: Yerelleştirme'ye tıklayarak yerelleştirme için.
    3. Parametreleri ayarlayın (tepe emisyonu: 664 nm; gecikme süresi: 500 ms) OPT > Sayfa: Edinme'ye tıklayarak edinme için.
    4. Seçilen parametrelerin uygun olduğundan emin olmak için tüm moleküllerin lokalizasyonlarını tek bir çerçevede görselleştirin (TEST LOC). Uygun değilse, 5.2.2 ve 5.2.3 adımlarındaki parametreleri değiştirin ve bu adımı tekrarlayın.
    5. Her karedeki tüm moleküllerin lokalizasyonlarını içeren bir dosya oluşturun (LOC ALL).
    6. SLIMfast'> Parçacık Verilerini Yükle'ye tıklayarak dosyayı 5.2.5'ten SLIMfast'> yükleyin.
    7. Parametreleri ayarlayın (beklenen maksimum difüzyon katsayısı: 0,1 μm2/s; maksimum yarışmacı sayısı: 5) OPT > Sayfası: İzleme'ye tıklayarak yörünge oluşturma için.
    8. Tüm moleküllerin yörüngelerini içeren bir dosya oluşturun (GEN TRAJ).
  3. Yapay olarak kısa yörüngelerle sonuçlanan izleme hatalarını hesaba katmak için Drosopoulos ve ark.43'te bulunan evalSPT39'u kullanarak tmin, 2,5 s'den daha kısa yörüngeleri filtreleyin.
    1. Dosyayı 5.2.8'den evalSPT'ye yükleyin (+ 5.2.8'den > OK'den > dosya).
    2. Parametreleri ayarlayın (min: 5 kare; Maks: 5.2.8'den itibaren dosya için maksimum yörünge uzunluğu) 2.5 s'den kısa yörüngeleri filtrelemek için.
    3. Filtrelenmiş tüm yörüngeleri içeren bir dosya oluşturun (VERİLERİ DIŞA AKTAR).
  4. Bu adımı yalnızca ilgilenilen proteinin yörüngeleri için izleyin. Yörüngeleri kondensatlarda ve kondensatlarda olanlara göre sıralayın, ardından ortalama kondens içinde kalma süresini çıkarın.
    NOT: Bu bölümdeki tüm kodlar Chong ve ark.1'de mevcuttur.
    1. ImageJ makrosunu, çekirdeğini ve küme mask_v2.txt çalıştırarak ve istemleri izleyerek yoğunlaşma konumlarını vurgulayan zaman atlamalı bir film oluşturmak için JFX549 kanalında alınan filmin tüm karelerini eşikleyin.
    2. 5.3.3'te oluşturulan tek moleküllü yörüngeleri yeniden biçimlendirin. MATLAB komut dosyasını, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak. (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; Çözünürlük, 0,16 μm/piksel).
    3. Yörüngeleri, belirli bir molekülün bir kondensatta (F) geçirdiği ömrün kesirine göre, MATLAB komut dosyasını (categorization_v4.m) kullanarak ve dosya adlarını ve yolları gerektiği gibi ayarlayarak sıralayın.
    4. Yalnızca yoğuşma yörüngelerini kullanarak devam edin.
  5. kobs,s ve kpb'yi çıkarın ve düzeltilmiş ortalama kalış süresini hesaplayın, figure-protocol-12279.
    1. MATLAB komut dosyasını, PLOT_ResidenceHist_css.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak ilgilenilen yörüngelerin kondensat proteininden kobs,s'yi çıkarın.
      (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; StartFrameForFit, 5 kare).
    2. MATLAB komut dosyasını, PLOT_ResidenceHist_css.m'yi kullanarak ve dosya adlarını, yolları ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak H2B yörüngelerinden kpb'yi çıkarın.
      (Parametreler: Pozlama, 0,5 sn; StartFrameForFit, 5 kare).
    3. İlgilenilen proteinin özellikle kondensatlarına bağlı düzeltilmiş ortalama kalış süresini hesaplayın, figure-protocol-13137,
      figure-protocol-13230
      NOT: 300 ms ve 800 ms gibi hareketli parçacıkları bulanıklaştırmak için yeterince uzun olan farklı maruz kalma sürelerinin, ilgilenilen proteinin aynı ortalama kalma süresiyle sonuçlandığını doğrulamak için kontroller yapılmalıdır.

Sonuçlar

Burada, iki proteinin kendi kendine bir araya gelen LLPS kondensatlarındaki etkileşim dinamiklerini karşılaştırmak için bu SPT protokolünü kullandığımız Irgen-Gioro ve ark.40'tan temsili sonuçlar sunuyoruz. TAF15 (TATA-kutu bağlayıcı protein ilişkili faktör 15), insan hücrelerinde aşırı ekspresyon üzerine LLPS'ye maruz kalabilen bir IDR içerir. 24 alt birimli bir oligomer oluşturan TAF15 (IDR) ile FTH1 (ferritin ağır zincir 1) arasında kaynaştırmanın, LLPS'yi yönle...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol, Irgen-Gioro ve ark.40'ta araştırılanlar gibi sistemler için tasarlanmıştır. Uygulamaya bağlı olarak, protokolün bazı bileşenleri değiştirilebilir, örneğin, floresan etiketli hücre hatları oluşturma yöntemi, floresan etiketleme sistemi ve kullanılan lamel stili. Bir hücredeki bir proteinin halo etiketlemesi, belirli bir deney için hangisinin daha uygun olduğuna bağlı olarak iki strateji kullanılarak yapılabilir. 1) Eksojen ekspresyon: ilgilenilen...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından Hibe No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Ödülü (S.C.), Searle Scholar Ödülü (S.C.), Shurl ve Kay Curci Vakfı Araştırma Bursu (S.C.), Merkin İnovasyon Tohum Hibesi (S.C.), Mallinckrodt Araştırma Bursu (S.C.) ve Margaret E. Erken Tıbbi Araştırma Vakfı 2024 Hibesi (SC). SC ayrıca NIH/NCI tarafından P30CA016042 Numaralı Ödül altında desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

Referanslar

  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030 (2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379 (2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474 (2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049 (2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787 (2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -. T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776 (2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357 (2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903 (2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280 (2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329 (2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 203sel d zensiz proteinlerprotein ba lanma dinami ibiyomolek ler kondensatlars v s v faz ayr mtek par ac k izlemefloresan mikroskobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır