ثلاث استراتيجيات للحث على التهاب القرنية العصبي وتجديد الأعصاب في قرنية الفئران

Summary

هنا ، نقترح ثلاث طرق مختلفة لإتلاف الألياف الحسية التي تعصب القرنية. تسهل هذه الطرق دراسة تجديد المحور العصبي في الفئران. هذه الطرق الثلاث ، القابلة للتكيف مع النماذج الحيوانية الأخرى ، مثالية لدراسة فسيولوجيا تعصيب القرنية وتجديدها.

Abstract

القرنية هي نسيج شفاف يغطي العين وهو ضروري لرؤية واضحة. هذا هو النسيج الأكثر تعصبا في الجسم. يوفر هذا التعصيب الإحساس والوظيفة الغذائية للعين ويساهم في الحفاظ على سلامة القرنية. يسمى الاضطراب المرضي لهذا التعصيب التهاب القرنية العصبي. يمكن أن يحدث هذا بسبب إصابة العين أو الجراحة أو المرض. في هذه الدراسة ، نقترح ثلاثة بروتوكولات مختلفة لإلحاق الضرر بالتعصيب بطرق تلخص الأنواع الثلاثة من الحالات التي تتم مواجهتها بشكل عام في العيادة.

تتمثل الطريقة الأولى في عمل تآكل للظهارة باستخدام لدغ عيني. يتضمن ذلك إزالة الطبقة الظهارية والنهايات العصبية الحرة والضفيرة تحت القاعدية بطريقة مشابهة لجراحة استئصال القرنية الانكسارية الضوئية التي يتم إجراؤها في العيادة. الطريقة الثانية تستهدف فقط التعصيب عن طريق تقسيمه في المحيط بلكمة خزعة ، والحفاظ على سلامة الظهارة. تشبه هذه الطريقة الخطوات الأولى من رأب القرنية الصفائحي وتؤدي إلى تنكس التعصيب يليه إعادة نمو المحاور العصبية في القرنية المركزية. الطريقة الأخيرة تدمر تعصيب نموذج الماوس المعدل وراثيا باستخدام مجهر متعدد الفوتونات ، والذي يحدد على وجه التحديد موقع الكي للألياف العصبية الفلورية. هذه الطريقة تلحق نفس الضرر مثل التهاب القرنية الضوئي ، وهو التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية.

تصف هذه الدراسة خيارات مختلفة للتحقيق في علم الأمراض الفسيولوجي لتعصيب القرنية ، وخاصة تنكس وتجديد المحاور. تعزيز التجديد أمر بالغ الأهمية لتجنب مضاعفات مثل عيوب الظهارة أو حتى ثقب القرنية. يمكن أن تساعد النماذج المقترحة في اختبار جزيئات دوائية جديدة أو علاج جيني يعزز تجديد الأعصاب ويحد من تطور المرض.

Introduction

تتكون القرنية، وهي السطح الشفاف للعين، من ثلاث طبقات متميزة: الظهارة، والسدى والبطانة. يحتوي هذا العضو على أعلى كثافة للتعصيب في الجسم ويتكون بشكل أساسي من ألياف حسية (النوعان Aδ و C) تنشأ من فرع العيون من العقدة ثلاثية التوائم. تخترق الألياف الحسية محيط القرنية في منتصف السدى على شكل حزم كبيرة تتفرع لتغطية السطح. ثم تتشعب لتخترق غشاء بومان وتشكل الضفيرة تحت القاعدية ، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة عن طريق تكوين دوامة في وسط القرنية. تنتهي هذه الألياف كنهايات عصبية حرة على السطح الخارجي للظهارة. فهي قادرة على تحويل المحفزات الحرارية والميكانيكية والكيميائية وإطلاق العوامل الغذائية الضرورية لتوازن الظهارة ^1,2. التهاب القرنية العصبي (NK) هو مرض تنكسي يؤثر على التعصيب الحسي للقرنية. ينبع هذا المرض النادر من انخفاض أو فقدان حساسية القرنية مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الدموع وضعف خصائص الشفاء من القرنية³. يتقدم NK من خلال ثلاث مراحل موصوفة جيدا ، من المرحلة 1 حيث يعاني المرضى من عيوب ظهارية ، إلى المرحلة 3 حيث يحدث ذوبان اللحمة و / أو ثقب القرنية⁴.

سريريا ، يمكن أن تكون أصول هذا المرض متنوعة. يمكن للمرضى فقدان تعصيب القرنية بعد الإصابة الجسدية للعين أو الجراحة أو من خلال الأمراض المزمنة ، مثل مرض السكري ^5,6. حتى الآن ، لا تزال عملية التسبب في NK غير مفهومة بشكل جيد ، والخيارات العلاجية لهذه الحالة التي تهدد البصر محدودة للغاية. لذلك ، هناك حاجة إلى فهم أفضل لخصائص العيوب الظهارية لفهم الآليات الكامنة وراء تجديد تلك الألياف بشكل أفضل وربما تعزيزها. هنا ، نقترح عدة نماذج لإصابة القرنية التي تحفز NK في الفئران.

النموذج الأول هو تآكل الطبقة الظهارية للقرنية مع لدغ العين. تمت دراسة هذا النموذج بشكل أساسي في سياق تجديد الظهارة في المختلفة ، مثل القوارض والأسماك^7،8،9 ، واختبار الجزيئات التي تعزز شفاء القرنية^10،11. من الناحية الفسيولوجية ، يستغرق الأمر 2-3 أيام حتى تغلق الخلايا الظهارية الجرح. ومع ذلك ، فإن النمط الفسيولوجي للتعصيب يستغرق أكثر من أربعة أسابيع للتعافي من التآكل^12,13. أثناء الجراحة ، يزيل نتوء العين الطبقة الظهارية للقرنية التي تحتوي على الضفيرة تحت القاعدية والنهايات العصبية الحرة للألياف. يمكن مقارنة هذا الإجراء سريريا بالمرضى الذين يعانون من استئصال القرنية الانكساري الضوئي (PRK) لتصحيح عيوب انكسار العين. يتكون الإجراء من إزالة ظهارة القرنية ثم إعادة تشكيل السدى باستخدام الليزر¹⁴. يمكن للمرضى تجربة العديد من الآثار الجانبية بعد هذه الجراحة ، مثل انخفاض كثافة عصب القرنية لمدة 2 سنوات وانخفاض في الحساسية لمدة 3 أشهر إلى سنة واحدة بعد^{الجراحة 15}. بالنظر إلى أن الجراحة تؤدي إلى هشاشة البيئة المكروية للقرنية ، يمكن أن يساعد هذا النموذج في التحقيق في هذه الآثار الجانبية وتطوير مناهج علاجية من شأنها تعزيز إعادة التعصيب بشكل أسرع ، وبالتالي تقليل الآثار الجانبية المعنية.

يتكون النموذج الثاني من تقسيم المحاور العصبية في محيط القرنية باستخدام خزعة ، مما يؤدي إلى تنكس والر للتعصيب المركزي ¹⁶. سريريا ، يمكن مقارنة هذه الطريقة برأب القرنية الصفائحي الأمامي ، حيث يدرك الجراح عملية نقوش جزئية للقرنية لإزالة جزء من السماكة الأمامية للقرنية واستبدالها بزرع متبرع ¹⁷. بعد رأب القرنية الرقائقي ، قد يعاني المرضى من عدد من الأعراض بما في ذلك جفاف العين وفقدان تعصيب القرنية ورفض الكسب غير المشروع¹⁸. يمكن أن يوفر نموذج بضع البديهية هذا الذي يتم إجراؤه على أعصاب القرنية نظرة ثاقبة لآليات تنكس الألياف ، والذي يحدث بعد الكسب غير المشروع ، يليه تجديد المحاور.

الطريقة الثالثة تدمر أعصاب القرنية بالليزر. باستخدام مجهر متعدد الفوتونات على قرنية المخدرة ، يحدث تنكس الأعصاب المترجمة في المجال البصري نتيجة لتكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي والتجويف الخلوي¹⁹. تلخص هذه الطريقة التلف الضوئي للقرنية الناجم عن التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية الطبيعية (حروق الشمس) ، والتي تؤدي أيضا إلى تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي²⁰. يعاني المرضى الذين يعانون من حروق الشمس في القرنية من ألم شديد ، حيث أن تدهور الخلايا الظهارية يحرم أطراف ألياف القرنية من الجميع.

تم تصميم الطرق الثلاث الموضحة هنا لتمكين التحقيق في عملية التسبب في NK وتجديد المحور العصبي. فهي قابلة للتكرار بسهولة ودقيقة. علاوة على ذلك ، فهي تسمح بالشفاء السريع والمراقبة السهلة للحيوانات.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل المجلس الوطني للتجارب الحيوانية.

1. الاستعدادات

1. تحضير محلول مخدر من الكيتامين زيلازين للتخدير. حقن الكيتامين بمعدل 80 ملغم/كغ والزيلازين عند 10 ملغم/كغ عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من الكيتامين (100 ملغم/مل) و125 ميكرولتر من الزيلازين (20 ملغ/مل) في 2175 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.
2. تحضير محلول البوبرينورفين 0.02 مجم / مل كمحلول مسكن عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 0.3 مجم / مل من البوبرينورفين إلى 1400 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.
3. تحضير محلول تلطيخ الفلورسنت.
   1. استخدم مقياسا دقيقا لوزن 10 مجم من ملح الفلوريسئين وقم بتخفيفه في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للحصول على محلول فلوريسئين 0.1٪.
   2. حماية الحل من الضوء ويهز لمدة 5 دقائق. استخدم حقنة سعة 10 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرومتر لتصفية المحلول.
      ملاحظة: يجب حماية محلول الفلورسنت من الضوء ويمكن تخزينه عند +4 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
4. تحضير الماوس
   1. وزن الفأر وتحفيز التخدير عن طريق إجراء حقن داخل الصفاق من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الفأر (MW) من محلول التخدير. عندما يتوقف الماوس عن الحركة ، ضعه على طبق ساخن (37 درجة مئوية) وتحقق من تخديره تماما عن طريق قرص أصابع قدميه.
   2. ضع قطرة من المسيل للدموع الاصطناعية على العين التي تخضع للجراحة وقطرة من هلام العين على العين المقابلة.
   3. بمجرد أن لا يستجيب الفأر للقرص ، قم بحقن التسكين (0.02 مجم / مل من البوبرينورفين) عند 5 ميكرولتر / جم من MW لتوفير 0.1 مجم / كجم من البوبرينورفين تحت الجلد في الرقبة.

2. تآكل القرنية

1. اتبع الخطوة 1.3 لتحضير محلول تلطيخ الفلورسنت.
2. اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس.
3. قبل القيام بالتآكل ، اغمس نتوء العين في 70٪ EtOH ثم في برنامج تلفزيوني لتنظيفه.
4. ضع الماوس على طبق ساخن (37 درجة مئوية) على الجانب للوصول بسهولة إلى العين التي تخضع للجراحة.
   1. استخدم قطعة قطن لامتصاص الدموع الاصطناعية وفرشاة الرموش بعيدا دون لمس العين.
   2. قم بتشغيل لدغ العين ، وافتح جفن الماوس بإصبعين ، وقم في نفس الوقت بسد الاهتزازات لتجنب تعلقها في الأزيز.
5. توطين التلميذ أو مركز العين وتطبيق نتوء العين على سطح العين ، والقيام بحركات دائرية. من خلال النظر عن كثب ، يمكن ملاحظة سطح الظهارة التي تمت إزالتها. خلاف ذلك ، قم بحوالي 20 حركة دائرية على القرنية.
6. ضع الفأر مرة أخرى على بطنه وتحقق مما إذا كان هلام العين لا يزال موجودا في العين المقابلة.
7. ضع قطرة من محلول تلطيخ الفلورسنت على العين المتآكلة وانتظر لمدة 20 ثانية. امتصاص القطرة بمنديل دون لمس العين وشطفها بقطرة من المسيل للدموع الاصطناعية. امتصاص قطرة المسيل للدموع الاصطناعية مع الأنسجة وإلقاء الضوء على العين مع مصباح الكوبالت الأزرق.
   ملاحظة: يجب أن يكون للتآكل شكل دائري. يتطلب بعض التدريب للحصول عليه.
8. ضع قطرة من جل العين على العين المتآكلة واترك الماوس يستيقظ على الوسادة الساخنة. عندما يتحرك الماوس من تلقاء نفسه ، أعده إلى قفصه.
9. تحقق من رفاهية خلال الأيام التالية 2.
10. بعد استخدام لدغ العين ، استخدم منديلا رخويا لإزالة الخلايا الظهارية العالقة في رأس النتوء وغمسها في 70٪ EtOH ثم PBS.
    ملاحظة: بمجرد إزالة الخلايا الظهارية بالأنسجة الرخوة ، تأكد من عدم وجود قطع من الأنسجة عالقة في رأس الأزيز.

3. استئصال أعصاب القرنية

1. اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس.
2. ضع الفأر تحت عدسة مجهر على الجانب للوصول إلى العين التي تخضع للجراحة. ضع الجزء السفلي من طبق بتري تحت رأس الماوس حتى تكون العين أفقية.
   ملاحظة: سيتم تنفيذ الخطوات التالية من خلال النظر من خلال العدسة مجهر.
3. قم بإزالة المسيل للدموع الاصطناعية بقطعة قطن وإزالة الرموش دون لمس العين.
4. ضع كماشة منحنية ناعمة تحت عين لإخراجه من المدار. تأكد من إغلاق الزردية بما يكفي حتى لا تتمكن العين من العودة إلى المدار بمجرد الضغط ، ولكن ليس بشكل مفرط لمنع تلف العصب البصري.
5. ضع لكمة الخزعة 2.5 مم عموديا على العين دون ضغط لضمان التلامس التام للثقب مع سطح القرنية.
   ملاحظة: بمجرد تطبيق اللكمة على القرنية ، قد تتداخل يد المجرب مع مجال الرؤية.
6. ثم ابدأ في الضغط ولف اللكمة عدة مرات.
   ملاحظة: اعتمادا على الضغط ، قد يختلف عدد الالتواءات ، ولكن بشكل عام يكون حوالي 5. يتطلب التدريب ليشعر بالضغط والحركة المناسبين. إذا تم تطبيق الكثير من الضغط ، تمزق العين. في هذه الحالة ، يمكن ملاحظة خروج السائل من الآفة وتليين العين. يجب التضحية بالحيوان.
7. إزالة لكمة الخزعة. يجب أن تكون الدائرة مرئية على القرنية حيث تم تطبيق لكمة الخزعة.
   ملاحظة: الخطوات التالية لا تتطلب العدسة مجهر.
8. تحقق مما إذا كانت العين المقابلة لا تزال تحتوي على هلام العين وقم بتطبيق بعضها على العين المحورية.
9. دع الفأر يستيقظ على وسادة ساخنة (37 درجة مئوية) وأعده إلى قفصه عندما يتحرك من تلقاء نفسه.
10. تحقق من رفاهية خلال الأيام التالية 2.

4. القرنية تجهيز جبل كامل

1. جمع العينات وتثبيتها.
   1. وزن الفأر والحث على التخدير عن طريق إجراء حقن داخل الصفاق من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الماوس (MW) من محلول التخدير.
   2. عندما يتوقف الماوس عن الحركة وليس لديه ردود فعل عن طريق معسر إصبع القدم ، قم بإجراء خلع عنق الرحم.
   3. أخرج العين من المدار باستخدام إصبعين وقم باستئصال العين عن طريق قطع العصب البصري باستخدام مقص منحني.
   4. ضع العين في أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني.
   5. ثبت العين عن طريق استبدال PBS ب 4٪ بارافورمالدهيد ووضعه على شاكر (30 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
   6. شطف 3 مرات لمدة 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
2. تشريح القرنية
   1. ضع قطرة من برنامج تلفزيوني على قطعة من البارافيلم داخل طبق بتري.
   2. ضع العين في هذه القطرة من برنامج تلفزيوني.
   3. ضع طبق بتري تحت العدسة مجهر.
   4. تشريح القرنية باستخدام مقص التشريح المجهري والملقط. قطع فوق الجسم الهدبي للحفاظ على limbus.
   5. قم بإزالة العدسة والجسم الهدبي والقزحية باستخدام ملقط ناعم.
   6. ضع القرنية مرة أخرى في أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل.
3. بروتوكول التألق المناعي
   1. احتضان القرنية في 2 مل من 2.5٪ جيلاتين جلد السمك ، 5٪ مصل الماعز ، و 0.5٪ منظف في PBS لمدة 1 ساعة في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
   2. احتضان القرنية في 150 ميكرولتر من محلول يحتوي على 2.5٪ جيلاتين جلد السمك ، و 5٪ مصل الماعز ، و 0.1٪ منظف في PBS يحتوي على الجسم المضاد الأساسي المخفف عند 1/1000 (الجسم المضاد للتوبولين βIII) طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
   3. شطف 3 مرات لمدة 1 ساعة مع 0.1 ٪ المنظفات في PBS في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
   4. احتضان القرنية في نفس المحلول كما في الخطوة 4.3.2 ، التي تحتوي على الجسم المضاد الثانوي المخفف عند 1/500 طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
   5. شطف 3 مرات لمدة 1 ساعة مع PBS في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
   6. احتضان القرنية لمدة 10 دقائق مع 150 ميكرولتر من مقحم الحمض النووي المخفف عند 1/5000 في RT على شاكر (30 دورة في الدقيقة).
   7. شطف 2 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
4. تصاعد القرنية
   1. ضع القرنية على شريحة ، ظهارة تواجه الشريحة ، واستخدم مشرطا لإنشاء أربعة أقسام دون الوصول إلى المركز.
      ملاحظة: قم بعمل الأقسام المقابلة لبعضها البعض لتشكيل شكل زهرة.
   2. ضع بطانة القرنية في مواجهة الشريحة وقم بإزالة PBS حول القرنية باستخدام منديل.
      ملاحظة: لا تقم بإزالة برنامج تلفزيوني تحت القرنية; خلاف ذلك ، قد تظهر فقاعات الهواء. إذا كان الأمر كذلك ، أضف برنامج تلفزيوني إلى القرنية وقم بإزالة فقاعة الهواء. ثم أعد التشغيل من الخطوة 4.3.2.
   3. أضف لصق النموذج على الزوايا الأربع لغطاء مستطيل.
      ملاحظة: يرفع معجون النموذج غطاء الغطاء لأن القرنية عبارة عن نسيج سميك.
   4. قم بإسقاط 50 ميكرولتر من وسط التثبيت على القرنية وضع الغطاء أعلاه بعناية لتجنب تكوين الفقاعة.
   5. أغلق الغطاء بطلاء الأظافر.
5. التصوير
   1. ضع الشريحة تحت المجهر الفلوري.
   2. حدد حجم الفسيفساء وعمق الصورة وابدأ عملية الاستحواذ.
   3. قم بتطبيق برنامج إزالة الضبابية وإزالة الالتفاف على الصورة المكتسبة.
      ملاحظة: الخطوة 4.6.3 هي خيار محدد في برنامج الاستحواذ (المقاصة الحسابية كبيرة الحجم [LVCC])

5. الاجتثاث بالليزر الموضعي لأعصاب القرنية

1. قم بتشغيل المجهر متعدد الفوتون المستقيم والليزر جنبا إلى جنب مع مذبذب حدودي بصري. قم بتنشيط المرحلة الساخنة للمجهر (37 درجة مئوية) واضبط الليزر على 850 نانومتر و 1100 نانومتر ، بما يتوافق مع الأطوال الموجية المطلوبة لنموذج الماوس.
2. استخدم مقياس الطاقة لضبط طاقة الليزر في وقت واحد عند حوالي 20 ميجاوات.
3. اتبع الخطوة 1.4 لتحضير الماوس وتطبيق هلام العين على كلتا العينين.
   ملاحظة: يجب أن يكون المستخدم في هذا البروتوكول من خط فأر معدل وراثيا (MAGIC-Marker للفأر^{المعدل وراثيا 21}) يعبر عن فلوروفور داخلي المنشأ في الألياف العصبية للقرنية.
4. تثبيت في حامل الرأس. أدر 90 درجة للعين المثيرة للاهتمام لمواجهة السقف.
5. اربط اهتزازات لتنظيف منطقة العين. اربط جسم لتقليل حركة الرأس الناتجة عن التنفس.
6. ضع غطاء دائريا على العين فوق جل العين. يجب أن يكون غطاء الغطاء أفقيا. لا تتردد في تحريك رأس حتى يتم وضع الغطاء بشكل صحيح.
7. أضف قطرة من PBS فوق قسيمة الغلاف. ضع على مرحلة المجهر بعناية واضبط البرج الموضوعي على المسافة الصحيحة.
8. استخدم الهدف المائي 20x و epifluorescence لتوطين العين والتعصيب من خلال العدسة.
9. قم بتنشيط الليزر وتحديد العمق الذي يجب إضاءته.
10. احصل على صورة بدقة 1024 × 1024 (بكسل) بسرعة اكتساب تتراوح بين 70٪ و85٪ من الحد الأقصى لسرعة المسح الضوئي.
11. بمجرد الحصول على الصورة ، أخرج من المجهر وقم بإزالة غطاء الغطاء والأشرطة. أخرج من حامل الرأس ، وأضف المزيد من جل العين إذا لزم الأمر ، واتركه يستيقظ في قفص على طبق ساخن.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة تدمير التعصيب بعد 1 أسبوع من التصوير. يمكن تكرار هذا البروتوكول مرة واحدة في الأسبوع لعدة أسابيع لزيادة الضرر الناجم عن الليزر.
12. عندما يتحرك من تلقاء نفسه ، ضع القفص مرة أخرى في الإسطبل وتحقق من سلامته لمدة 2 أيام التالية.

النتائج

تقترح هذه الدراسة عدة بروتوكولات لإلحاق الضرر بتعصيب القرنية في الفئران. بينما تم استخدام بروتوكولات مماثلة للتحقيق في علم الأمراض الفسيولوجي لشفاء الظهارة ، اخترنا تكييف وتطوير طرق جديدة للتحقيق في تجديد تعصيب القرنية. لمراقبة التعصيب ، استخدمنا تقنيتين. أولا ، استخدمنا تقنية التألق ا?...

Discussion

يعتبر التهاب القرنية العصبي مرضا نادرا يصيب 5 من كل 10000 فرد. ومع ذلك ، فإن الأشخاص الذين يعانون من NK بسبب إصابة جسدية مثل الحروق الكيميائية ، أو متلازمات مثل مرض السكري أو التصلب المتعدد غير مدرجين في تلك الإحصاءات³. علاوة على ذلك ، لا تزال هذه الحالة غير مشخصة بشكل كبير

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium