Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Özet

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Özet

Kornea, gözü kaplayan şeffaf bir dokudur ve net görüş için çok önemlidir. Vücutta en çok innerve edilen dokudur. Bu innervasyon, göze duyu ve trofik fonksiyon sağlar ve kornea bütünlüğünün korunmasına katkıda bulunur. Bu innervasyonun patolojik bozulması nörotrofik keratit olarak adlandırılır. Bu, göz yaralanması, ameliyat veya hastalık ile tetiklenebilir. Bu çalışmada, klinikte genel olarak karşılaşılan üç tip vakayı özetleyecek şekilde innervasyona hasar vermek için üç farklı protokol öneriyoruz.

İlk yöntem, oftalmik bir çapak ile epitelin aşındırılmasından ibarettir. Bu, epitel tabakasının, serbest sinir uçlarının ve subbazal pleksusun klinikte yapılan fotorefraktif keratektomi ameliyatına benzer bir şekilde çıkarılmasını içerir. İkinci yöntem, epitelin bütünlüğünü koruyarak, biyopsi zımbası ile periferde kesitlere ayırarak innervasyonu hedefler. Bu yöntem, lameller keratoplastinin ilk adımlarına benzer ve innervasyonun dejenerasyonuna ve ardından merkezi korneadaki aksonların yeniden büyümesine yol açar. Son yöntem, floresan sinir liflerinin koterizasyon bölgesini spesifik olarak lokalize eden bir multifoton mikroskobu kullanarak transgenik bir fare modelinin innervasyonuna zarar verir. Bu yöntem, UV ışığına aşırı maruz kalma olan fotokeratit ile aynı hasarı verir.

Bu çalışmada kornea innervasyonunun fizyopatolojisini, özellikle aksonların dejenerasyonu ve rejenerasyonunu araştırmak için farklı seçenekler tanımlanmıştır. Rejenerasyonu teşvik etmek, epitel kusurları ve hatta korneanın delinmesi gibi komplikasyonlardan kaçınmak için çok önemlidir. Önerilen modeller, sinir rejenerasyonunu artıran ve hastalığın ilerlemesini sınırlayan yeni farmakolojik moleküllerin veya gen terapisinin test edilmesine yardımcı olabilir.

Giriş

Gözün saydam yüzeyi olan kornea, epitel, stroma ve endotel olmak üzere üç ayrı katmandan oluşur. Bu organ vücuttaki en yüksek innervasyon yoğunluğuna sahiptir ve esas olarak trigeminal ganglionun oftalmik dalından kaynaklanan duyusal liflerden (Aδ ve C tipleri) oluşur. Duyusal lifler, stromanın ortasında korneanın çevresine, yüzeyi kaplamak için dallanan büyük demetler şeklinde nüfuz eder. Daha sonra Bowmann'ın zarını delmek için çatallanırlar ve korneanın merkezinde bir girdap oluşumuyla kolayca tanınabilen subbazal pleksusu oluştururlar. Bu lifler epitelin dış yüzeyinde serbest sinir uçları olarak sonlanır. Termal, mekanik ve kimyasal uyaranları iletebilir ve epitel....

Protokol

Tüm deneyler Ulusal Hayvan Deney Kurulu tarafından onaylandı.

1. Hazırlıklar

1. Anestezi için anestezik bir ketamin-ksilazin çözeltisi hazırlayın. 200 μL ketamin (100 mg/mL) ve 125 μL ksilazin (20 mg/mL) 2.175 mL steril% 0.9 NaCl içinde seyrelterek 80 mg / kg'da ketamin ve 10 mg / kg'da ksilazin enjekte edin.
2. 1.400 mL steril %0.9 NaCl'ye 100 μL 0.3 mg/mL buprenorfin ekleyerek analjezik çözelti olarak 0.02 mg/mL buprenorfin çözeltisi hazırlayın.
3. Floresan boyama solüsyonunu hazırlayın.
   1. 10 mg floresein tuzunu tartmak için ince bir ölçek kullanın ve% 0.1'lik bir floresein çözeltisi eld....

Tartışmalar

Nörotrofik keratit, 10.000 kişiden 5'ini etkileyen nadir bir hastalık olarak kabul edilir. Bununla birlikte, kimyasal yanıklar gibi fiziksel bir yaralanma veya diyabet veya multipl skleroz gibi sendromlar nedeniyle NK'dan muzdarip kişiler bu istatistiklere dahil edilmemiştir³. Ayrıca, bu durum önemli ölçüde yetersiz teşhis edilmektedir²² ve hastalığın prevalansı hafife alınmaktadır. Hastaların görüşünü korumanın bir yolu olarak akson rejenerasyonunu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium