Drei Strategien zur Induktion von neurotropher Keratitis und Nervenregeneration in der murinen Hornhaut

Zusammenfassung

Hier schlagen wir drei verschiedene Methoden vor, um die sensorischen Fasern, die die Hornhaut innervieren, zu schädigen. Diese Methoden erleichtern die Untersuchung der Axonregeneration bei Mäusen. Diese drei Methoden, die auf andere Tiermodelle adaptierbar sind, sind ideal für die Untersuchung der Physiologie und Regeneration der Hornhautinnervation.

Zusammenfassung

Die Hornhaut ist ein transparentes Gewebe, das das Auge bedeckt und für eine klare Sicht entscheidend ist. Es ist das am stärksten innervierte Gewebe im Körper. Diese Innervation sorgt für Empfindung und trophische Funktion des Auges und trägt zur Erhaltung der Hornhautintegrität bei. Die krankhafte Störung dieser Innervation wird als neurotrophe Keratitis bezeichnet. Dies kann durch eine Verletzung des Auges, eine Operation oder eine Krankheit ausgelöst werden. In dieser Studie schlagen wir drei verschiedene Protokolle vor, um die Innervation auf eine Weise zu schädigen, die die drei Arten von Fällen rekapituliert, die im Allgemeinen in der Klinik auftreten.

Die erste Methode besteht darin, das Epithel mit einem ophthalmologischen Bohrer abzureiben. Dabei werden die Epithelschicht, die freien Nervenenden und der subbasale Plexus ähnlich wie bei der in der Klinik durchgeführten photorefraktiven Keratektomie entfernt. Die zweite Methode zielt nur auf die Innervation ab, indem sie an der Peripherie mit einer Biopsienstanze durchtrennt wird, um die Integrität des Epithels zu erhalten. Diese Methode ähnelt den ersten Schritten der lamellären Keratoplastik und führt zu einer Degeneration der Innervation mit anschließendem Nachwachsen der Axone in der zentralen Hornhaut. Die letzte Methode schädigt die Innervation eines transgenen Mausmodells mit Hilfe eines Multiphotonenmikroskops, das spezifisch den Ort der Kauterisierung der fluoreszierenden Nervenfasern lokalisiert. Diese Methode verursacht den gleichen Schaden wie eine Photokeratitis, eine übermäßige Bestrahlung mit UV-Licht.

Diese Studie beschreibt verschiedene Möglichkeiten zur Untersuchung der Physiopathologie der Hornhautinnervation, insbesondere der Degeneration und Regeneration der Axone. Die Förderung der Regeneration ist entscheidend, um Komplikationen wie Epitheldefekte oder sogar Perforationen der Hornhaut zu vermeiden. Die vorgeschlagenen Modelle können dabei helfen, neue pharmakologische Moleküle oder Gentherapien zu testen, die die Nervenregeneration verbessern und das Fortschreiten der Krankheit begrenzen.

Einleitung

Die Hornhaut, die transparente Oberfläche des Auges, besteht aus drei verschiedenen Schichten: dem Epithel, dem Stroma und dem Endothel. Dieses Organ hat die höchste Innervationsdichte im Körper und besteht hauptsächlich aus sensorischen Fasern (Typen Aδ und C), die aus dem ophthalmologischen Ast des Trigeminusganglions stammen. Sensorische Fasern dringen in Form von großen Bündeln in die Peripherie der Hornhaut im mittleren Stroma ein, die sich verzweigen, um die Oberfläche zu bedecken. Sie verzweigen sich dann, um die Bowmann-Membran zu durchstoßen und den subbasalen Plexus zu bilden, der leicht an der Bildung eines Wirbels in der Mitte der Hornhaut zu erkennen ist.....

Protokoll

Alle Versuche wurden von der Nationalen Tierversuchsbehörde genehmigt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie eine Anästhesielösung aus Ketamin-Xylazin für die Anästhesie vor. Injizieren Sie Ketamin mit 80 mg/kg und Xylazin mit 10 mg/kg, indem Sie 200 μl Ketamin (100 mg/ml) und 125 μl Xylazin (20 mg/ml) in 2.175 ml sterilem 0,9%igem NaCl verdünnen.
2. Bereiten Sie 0,02 mg/ml Buprenorphinlösung als analgetische Lösung vor, indem Sie 100 μl 0,3 mg/ml Buprenorphin zu 1.400 ml sterilem 0,9%igem NaCl hinzufügen.
3. Bereiten Sie die fluoreszierende Färbelösung vor.
   1. Mit einer feinen Waage werden 10 ....

Diskussion

Neurotrophe Keratitis gilt als seltene Erkrankung, von der 5 von 10.000 Personen betroffen sind. Menschen, die aufgrund einer körperlichen Verletzung wie Verätzungen oder Syndromen wie Diabetes oder Multipler Sklerose an NK leiden, sind jedoch nicht in dieser Statistik enthalten³. Darüber hinaus wird diese Erkrankung nach wie vor deutlich unterdiagnostiziert²² und die Prävalenz der Krankheit unterschätzt. Es besteht ein großer Bedarf an neuen Behandlungen und Therapie.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium