Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Resumo

Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

Resumo

A córnea é um tecido transparente que cobre o olho e é crucial para uma visão clara. É o tecido mais inervado do corpo. Essa inervação proporciona sensação e função trófica ao olho e contribui para preservar a integridade corneana. A ruptura patológica dessa inervação é denominada ceratite neurotrófica. Isso pode ser desencadeado por lesão no olho, cirurgia ou doença. Neste estudo, propomos três diferentes protocolos para causar dano à inervação de forma a recapitular os três tipos de casos geralmente encontrados na clínica.

O primeiro método consiste em fazer uma abrasão do epitélio com uma broca oftálmica. Trata-se da remoção da camada epitelial, das terminações nervosas livres e do plexo subbasal de forma semelhante à cirurgia de ceratectomia fotorrefrativa realizada na clínica. O segundo método visa apenas a inervação seccionando-a na periferia com um punch de biópsia, mantendo a integridade do epitélio. Este método é semelhante aos primeiros passos da ceratoplastia lamelar e leva a uma degeneração da inervação seguida de recrescimento dos axônios na córnea central. O último método danifica a inervação de um modelo de camundongo transgênico usando um microscópio multifóton, que localiza especificamente o local de cauterização das fibras nervosas fluorescentes. Este método inflige o mesmo dano que a fotoceratite, uma superexposição à luz UV.

Este estudo descreve diferentes opções para investigar a fisiopatologia da inervação corneana, particularmente a degeneração e regeneração dos axônios. Promover a regeneração é crucial para evitar complicações como defeitos do epitélio ou mesmo perfuração da córnea. Os modelos propostos podem ajudar a testar novas moléculas farmacológicas ou terapia gênica que melhoram a regeneração nervosa e limitam a progressão da doença.

Introdução

A córnea, que é a superfície transparente do olho, é composta por três camadas distintas: o epitélio, o estroma e o endotélio. Este órgão possui a maior densidade de inervação do corpo e é composto principalmente por fibras sensitivas (tipos Aδ e C) originárias do ramo oftálmico do gânglio trigeminal. As fibras sensoriais penetram na periferia da córnea no estroma médio na forma de grandes feixes que se ramificam para cobrir a superfície. Eles então se bifurcam para perfurar a membrana de Bowmann e formam o plexo subbasal, que é facilmente reconhecível pela formação de um vórtice no centro da córnea. Essas fibras terminam como terminações nervosas livres na superfície externa do epitélio. São capazes de transduzir estímulos térmicos, mecânicos, químicos e liberar fatores tróficos essenciais para a homeostase do epitélio ^1,2. A ceratite neurotrófica (NK) é uma doença degenerativa que afeta a inervação sensorial corneana. Esta doença rara decorre de uma diminuição ou perda da sensibilidade corneana que resulta em menor produção lacrimal e pobres propriedades cicatrizantes da córnea³. A NK evolui através de três estágios bem descritos, desde o estágio 1, onde os pacientes sofrem defeitos epiteliais, até o estágio 3, onde ocorre fusão estromal e/ou perfuração corneana⁴.

Clinicamente, as origens desta doença podem ser diversas. Os pacientes podem perder a inervação corneana após lesão física ocular, cirurgia ou por doenças crônicas, como diabetes ^5,6. Até o momento, o processo de patogênese da NK permanece pouco compreendido, e as opções terapêuticas para essa condição que ameaça a visão são muito limitadas. Portanto, um melhor entendimento das características dos defeitos epiteliais é necessário para melhor compreender os mecanismos por trás da regeneração dessas fibras e potencialmente promovê-los. Aqui, propomos vários modelos de lesão corneana que induzem NK em camundongos.

O primeiro modelo é a abrasão da camada epitelial da córnea com uma broca ocular. Esse modelo tem sido estudado principalmente no contexto da regeneração do epitélio em diferentes animais, como roedores^e peixes7,8,9, e para testar moléculas promotoras da cicatrização ^{corneana 10,11}. Fisiologicamente, leva 2-3 dias para que as células epiteliais fechem a ferida. O padrão fisiológico da inervação, entretanto, leva mais de quatro semanas para se recuperar da abrasão^12,13. Durante a cirurgia, a broca ocular remove a camada epitelial da córnea que contém o plexo subbasal e as terminações nervosas livres das fibras. Este procedimento pode ser clinicamente comparado a pacientes com ceratectomia fotorrefrativa (PRK) para correção de defeitos refrativos oculares. O procedimento consiste na remoção do epitélio da córnea e, em seguida, na remodelagem do estroma com laser¹⁴. Os pacientes podem apresentar vários efeitos colaterais após essa cirurgia, como diminuição da densidade do nervo corneano por 2 anos e redução da sensibilidade por um período de 3 meses a um ano após a cirurgia¹⁵. Como a cirurgia induz uma fragilidade do microambiente corneano, esse modelo poderia ajudar a investigar esses efeitos colaterais e desenvolver abordagens terapêuticas que promovessem reinervação mais rápida, reduzindo os efeitos colaterais em questão.

O segundo modelo consiste em seccionar os axônios na periferia da córnea com punch de biópsia, induzindo uma degeneração walleriana da inervação central ¹⁶. Clinicamente, esse método poderia ser comparado à ceratoplastia lamelar anterior, na qual o cirurgião realiza uma trepanação parcial da córnea para remover uma parte da espessura anterior da córnea e substituí-la por um transplante de doador ¹⁷. Após a ceratoplastia lamelar, os pacientes podem apresentar uma série de sintomas, incluindo olho seco, perda da inervação corneana e rejeição do enxerto¹⁸. Este modelo de axotomia realizada em nervos corneanos poderia fornecer informações sobre os mecanismos de degeneração das fibras, que ocorre após um enxerto, seguido pela regeneração dos axônios.

O terceiro método danifica os nervos da córnea com um laser. Utilizando-se microscópio multifóton na córnea de animais anestesiados, a degeneração dos nervos localizados no campo óptico é induzida como resultado da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que leva a danos no DNA e cavitação celular¹⁹. Esse método recapitula o fotodano corneano induzido pela superexposição aos raios UV naturais (queimaduras solares), que também desencadeiam a formação de EROs, levando a danos no DNA²⁰. Os pacientes que sofrem de queimadura solar da córnea experimentam grande dor, pois a deterioração das células epiteliais priva as extremidades das fibras corneanas de tudo.

Os três métodos aqui descritos são projetados para permitir a investigação do processo de patogênese NK e regeneração axonal. São facilmente reprodutíveis e precisos. Além disso, permitem rápida recuperação e fácil monitoramento dos animais.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo National Animal Experiment Board.

1. Preparações

1. Preparar uma solução anestésica de ketamina-xilazina para anestesia. Injetar cetamina a 80 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg diluindo 200 μL de cetamina (100 mg/mL) e 125 μL de xilazina (20 mg/mL) em 2.175 mL de NaCl 0,9% estéril.
2. Preparar 0,02 mg/mL de solução de buprenorfina como solução analgésica adicionando 100 μL de buprenorfina a 0,3 mg/mL a 1.400 mL de NaCl 0,9% estéril.
3. Prepare a solução de coloração fluorescente.
   1. Use uma balança fina para pesar 10 mg de sal fluoresceína e dilua-o em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter uma solução de fluoresceína a 0,1%.
   2. Proteja a solução da luz e agite-a durante 5 minutos. Use uma seringa de 10 mL e um filtro de seringa de 0,2 μm para filtrar a solução.
      NOTA: A solução fluorescente tem de ser protegida da luz e pode ser armazenada a +4 °C durante 5 dias.
4. Preparação do rato
   1. Pesar o camundongo e induzir a anestesia realizando uma injeção intraperitoneal de 10 μL/g de peso do camundongo (MW) da solução anestésica. Quando o rato parar de se mover, coloque-o numa placa aquecida (37 °C) e verifique se está completamente anestesiado apertando os dedos dos pés.
   2. Aplique uma gota de lágrima artificial no olho submetido à cirurgia e uma gota de gel ocular no olho contralateral.
   3. Uma vez que o camundongo não responde ao pinçamento, injetar a analgesia (0,02 mg/mL de buprenorfina) a 5 μL/g de MW para fornecer 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea no pescoço.

2. Abrasão da córnea

1. Siga o passo 1.3 para preparar a solução de coloração fluorescente.
2. Siga a etapa 1.4 para preparar o mouse.
3. Antes de fazer a abrasão, mergulhe a broca ocular em EtOH 70% e depois em PBS para limpá-la.
4. Coloque o mouse sobre uma placa aquecida (37 °C) na lateral para acessar facilmente o olho submetido à cirurgia.
   1. Use um cotonete para absorver a lágrima artificial e escove os cílios sem tocar no olho.
   2. Ligue a rebarba ocular, abra a pálpebra do rato com dois dedos e, simultaneamente, bloqueie as vibrissas para evitar que fiquem presas na rebarba.
5. Localize a pupila ou o centro do olho e aplique a broca ocular na superfície do olho, e faça movimentos circulares. Observando de perto, a superfície do epitélio removido pode ser observada. Caso contrário, faça aproximadamente 20 movimentos circulares na córnea.
6. Coloque o rato de volta na barriga e verifique se o gel ocular ainda está presente no olho contralateral.
7. Aplique uma gota de solução corante fluorescente sobre o olho abrasado e aguarde 20 s. Absorva a gota com um tecido sem tocar no olho e enxágue-o com uma gota de lágrima artificial. Absorva a gota da lágrima artificial com um tecido e ilumine o olho com a lâmpada de cobalto azul.
   NOTA: A abrasão tem que ter uma forma circular. Requer algum treinamento para obtê-lo.
8. Aplique uma gota de gel ocular no olho abrasado e deixe o mouse acordar na almofada aquecida. Quando o rato estiver se movendo por conta própria, coloque-o de volta em sua gaiola.
9. Verifique o bem-estar do animal durante os 2 dias seguintes.
10. Após o uso da broca ocular, utilizar um tecido mole para remover as células epiteliais presas na cabeça da broca e mergulhá-la em EtOH a 70% e, em seguida, PBS.
    NOTA: Uma vez que as células epiteliais são removidas com o tecido mole, certifique-se de que nenhum pedaço de tecido está preso na cabeça da rebarba.

3. Axotomia dos nervos corneanos

1. Siga a etapa 1.4 para preparar o mouse.
2. Coloque o rato sob uma lupa binocular na lateral para acessar o olho submetido à cirurgia. Coloque o fundo de uma placa de Petri sob a cabeça do mouse para que o olho fique horizontal.
   OBS: Os seguintes passos serão realizados através da observação através da lupa binocular.
3. Retire a lágrima artificial com um cotonete e remova os cílios sem tocar no olho.
4. Coloque um alicate curvo liso sob o olho do animal para tirá-lo da órbita. Certifique-se de fechar o alicate o suficiente para que o olho não possa voltar à órbita uma vez que a pressão é aplicada, mas não excessivamente para evitar danos ao nervo óptico.
5. Aplicar o punch de biópsia de 2,5 mm verticalmente no olho sem pressão para garantir o contato total do punch com a superfície da córnea.
   NOTA: Uma vez que o punch é aplicado contra a córnea, a mão do experimentador pode interferir no campo de visão.
6. Em seguida, comece a aplicar pressão e torça o soco várias vezes.
   NOTA: Dependendo da pressão, o número de torções pode variar, mas geralmente é em torno de 5. Requer treinamento para sentir a pressão e o movimento certos. Se for aplicada muita pressão, o olho se rompe. Neste caso, pode-se observar líquido saindo da lesão e o olho amolecer. O animal tem que ser sacrificado.
7. Remova o punch da biópsia. Um círculo deve ser visível na córnea onde o punch da biópsia foi aplicado.
   NOTA: Os próximos passos não requerem a lupa binocular.
8. Verifique se o olho contralateral ainda possui gel ocular e aplique um pouco no olho axotomizado.
9. Deixe o rato acordar numa almofada aquecida (37 °C) e coloque-o de volta na sua gaiola quando estiver a mover-se sozinho.
10. Verifique o bem-estar do animal durante os 2 dias seguintes.

4. Processamento de montagem completa da córnea

1. Coleta e fixação de amostras.
   1. Pesar o camundongo e induzir a anestesia realizando uma injeção intraperitoneal de 10 μL/g de peso do camundongo (MW) da solução anestésica.
   2. Quando o rato para de se mover e não tem reflexos por pinça dos dedos, realize uma luxação cervical.
   3. Coloque o olho para fora da órbita usando dois dedos e enuclee o olho cortando o nervo óptico usando uma tesoura curva.
   4. Coloque o olho em um tubo plástico de 2 mL contendo PBS.
   5. Fixe o olho substituindo o PBS por paraformaldeído a 4% e colocando-o em um agitador (30 rpm) à temperatura ambiente (TR) por 20 min.
   6. Enxaguar 3 vezes por 10 min com PBS no RT em um agitador (30 rpm).
2. Dissecção da córnea
   1. Coloque uma gota de PBS em um pedaço de parafilme dentro de uma placa de Petri.
   2. Coloque o olho nesta gota de PBS.
   3. Coloque a placa de Petri sob a lupa binocular.
   4. Dissecar a córnea com tesoura de microdissecção e pinça. Corte acima do corpo ciliar para manter o limbo.
   5. Retire o cristalino, o corpo ciliar e a íris com pinças finas.
   6. Coloque a córnea de volta em um tubo plástico de 2 mL.
3. Protocolo de imunofluorescência
   1. Incubar a córnea em 2 mL de gelatina de pele de peixe a 2,5%, soro de cabra a 5% e detergente a 0,5% em PBS por 1 h à RT em um agitador (30 rpm).
   2. Incubar a córnea em 150 μL de uma solução de gelatina de pele de peixe a 2,5%, soro de cabra a 5% e detergente a 0,1% em PBS contendo o anticorpo primário diluído a 1/1000 (anticorpo antitubulina βIII) durante a noite a 4 °C num agitador (30 rpm).
   3. Enxaguar 3 vezes por 1 h com detergente 0,1% em PBS no RT em um agitador (30 rpm).
   4. Incubar a córnea na mesma solução da etapa 4.3.2, contendo o anticorpo secundário diluído a 1/500 durante a noite a 4 °C num agitador (30 rpm).
   5. Enxaguar 3 vezes por 1 h com PBS no RT em um agitador (30 rpm).
   6. Incubar a córnea por 10 min com 150 μL de intercalador de DNA diluído a 1/5000 em RT em um agitador (30 rpm).
   7. Enxágue 2 vezes por 5 min com PBS.
4. Montagem da córnea
   1. Coloque a córnea em uma lâmina, epitélio voltado para a lâmina, e use um bisturi para criar quatro seções sem atingir o centro.
      Observação : fazer as seções opostas entre si para formar uma forma de flor.
   2. Coloque o endotélio da córnea voltado para a lâmina e remova o PBS ao redor da córnea usando um tecido.
      NOTA: Não remova o PBS sob a córnea; caso contrário, bolhas de ar podem aparecer. Em caso afirmativo, adicione PBS à córnea e remova a bolha de ar. Em seguida, reinicie a partir da etapa 4.3.2.
   3. Adicione a pasta de modelo nos quatro cantos de uma tampa retangular.
      NOTA: A pasta modelo eleva a lamínula, pois a córnea é um tecido espesso.
   4. Solte 50 μL de um meio de montagem sobre a córnea e coloque cuidadosamente a lamínula acima para evitar a formação de bolhas.
   5. Sele a tampa com esmalte.
5. Imagiologia
   1. Coloque a lâmina sob um microscópio epifluorescente.
   2. Defina o tamanho do mosaico e a profundidade da imagem e inicie a aquisição.
   3. Aplique um programa de desfoque e deconvolução na imagem adquirida.
      NOTA: A etapa 4.6.3 é uma opção selecionada no software de aquisição (Large Volume Computational Clearing [LVCC])

5. Ablação localizada a laser de nervos corneanos

1. Ligue o microscópio multifóton vertical e o laser combinado com um oscilador paramétrico óptico. Ativar o estágio aquecido do microscópio (37 °C) e ajustar os lasers em 850 nm e 1100 nm, correspondendo aos comprimentos de onda necessários para o modelo de camundongo.
2. Use um medidor de potência para ajustar a potência dos lasers simultaneamente em cerca de 20 mW.
3. Siga o passo 1.4 para preparar o rato e aplicar gel ocular em ambos os olhos.
   NOTA: O animal utilizado para este protocolo deve ser de uma linhagem transgênica de camundongos (camundongo transgênico MAGIC-Marker²¹) que expresse um fluoróforo endógeno nas fibras nervosas da córnea.
4. Instale o animal em um suporte de cabeça. Gire o animal 90° para o olho de interesse ficar de frente para o teto.
5. Prenda as vibrissas do animal para limpar a área dos olhos. Amarre o corpo do animal para diminuir o movimento da cabeça induzido pela respiração.
6. Posicione uma lamínula circular no olho acima do gel ocular. A tampa tem que ser horizontal. Não hesite em mover a cabeça do animal para que a tampa seja posicionada corretamente.
7. Adicione uma gota de PBS acima da tampa. Coloque o animal no palco do microscópio cuidadosamente e ajuste a torre objetiva na distância certa.
8. Use a objetiva aquosa de 20x e a epifluorescência para localizar o olho e a inervação através da ocular.
9. Ative os lasers e defina a profundidade que precisa ser iluminada.
10. Adquira imagens de 1024 x 1024 (pixels) a uma velocidade de aquisição de 70%-85% da velocidade máxima de varredura.
11. Uma vez adquirida a imagem, retire o animal do microscópio e retire a lamínula e as alças. Retire o animal do suporte da cabeça, adicione mais gel ocular, se necessário, e deixe-o acordar em uma gaiola em uma placa aquecida.
    NOTA: A destruição da inervação pode ser observada 1 semana após a aquisição de imagens. Este protocolo pode ser repetido uma vez por semana durante várias semanas para aumentar os danos causados pelos lasers.
12. Quando o animal estiver se movendo por conta própria, coloque a gaiola de volta no estábulo e verifique seu bem-estar pelos 2 dias seguintes.

Resultados

Este estudo propõe vários protocolos para causar danos à inervação corneana em camundongos. Embora protocolos semelhantes tenham sido utilizados para investigar a fisiopatologia da cicatrização do epitélio, optamos por adaptar e desenvolver novos métodos de investigação da regeneração da inervação corneana. Para a observação da inervação, foram utilizadas duas técnicas. Primeiro, empregamos uma técnica de imunofluorescência para corar as fibras nervosas usando um anticorpo pan-neuronal (tubulina BII...

Discussão

A ceratite neurotrófica é considerada uma doença rara, afetando 5 em cada 10.000 indivíduos. No entanto, pessoas que sofrem de NK devido a uma lesão física, como queimaduras químicas, ou síndromes, como diabetes ou esclerose múltipla, não são incluídas nessas^{estatísticas3}. Além disso, essa condição permanece significativamente subdiagnosticada²², e a prevalência da doença é subestimada. Há uma forte necessidade de novos tratamentos e terapias que promova...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium