Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Resumo

Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

Resumo

A córnea é um tecido transparente que cobre o olho e é crucial para uma visão clara. É o tecido mais inervado do corpo. Essa inervação proporciona sensação e função trófica ao olho e contribui para preservar a integridade corneana. A ruptura patológica dessa inervação é denominada ceratite neurotrófica. Isso pode ser desencadeado por lesão no olho, cirurgia ou doença. Neste estudo, propomos três diferentes protocolos para causar dano à inervação de forma a recapitular os três tipos de casos geralmente encontrados na clínica.

O primeiro método consiste em fazer uma abrasão do epitélio com uma broca oftálmica. Trata-se da remoção da camada epitelial, das terminações nervosas livres e do plexo subbasal de forma semelhante à cirurgia de ceratectomia fotorrefrativa realizada na clínica. O segundo método visa apenas a inervação seccionando-a na periferia com um punch de biópsia, mantendo a integridade do epitélio. Este método é semelhante aos primeiros passos da ceratoplastia lamelar e leva a uma degeneração da inervação seguida de recrescimento dos axônios na córnea central. O último método danifica a inervação de um modelo de camundongo transgênico usando um microscópio multifóton, que localiza especificamente o local de cauterização das fibras nervosas fluorescentes. Este método inflige o mesmo dano que a fotoceratite, uma superexposição à luz UV.

Este estudo descreve diferentes opções para investigar a fisiopatologia da inervação corneana, particularmente a degeneração e regeneração dos axônios. Promover a regeneração é crucial para evitar complicações como defeitos do epitélio ou mesmo perfuração da córnea. Os modelos propostos podem ajudar a testar novas moléculas farmacológicas ou terapia gênica que melhoram a regeneração nervosa e limitam a progressão da doença.

Introdução

A córnea, que é a superfície transparente do olho, é composta por três camadas distintas: o epitélio, o estroma e o endotélio. Este órgão possui a maior densidade de inervação do corpo e é composto principalmente por fibras sensitivas (tipos Aδ e C) originárias do ramo oftálmico do gânglio trigeminal. As fibras sensoriais penetram na periferia da córnea no estroma médio na forma de grandes feixes que se ramificam para cobrir a superfície. Eles então se bifurcam para perfurar a membrana de Bowmann e formam o plexo subbasal, que é facilmente reconhecível pela formação de um vórtice no centro da córnea. Essas fibras terminam como terminações nervosas livres na superfície....

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo National Animal Experiment Board.

1. Preparações

1. Preparar uma solução anestésica de ketamina-xilazina para anestesia. Injetar cetamina a 80 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg diluindo 200 μL de cetamina (100 mg/mL) e 125 μL de xilazina (20 mg/mL) em 2.175 mL de NaCl 0,9% estéril.
2. Preparar 0,02 mg/mL de solução de buprenorfina como solução analgésica adicionando 100 μL de buprenorfina a 0,3 mg/mL a 1.400 mL de NaCl 0,9% estéril.
3. Prepare a solução de coloração fluorescente.
   1. Use uma balança fina para pesar 10 mg de sal fluoresceína e dilua-o em 1....

Discussão

A ceratite neurotrófica é considerada uma doença rara, afetando 5 em cada 10.000 indivíduos. No entanto, pessoas que sofrem de NK devido a uma lesão física, como queimaduras químicas, ou síndromes, como diabetes ou esclerose múltipla, não são incluídas nessas^{estatísticas3}. Além disso, essa condição permanece significativamente subdiagnosticada²², e a prevalência da doença é subestimada. Há uma forte necessidade de novos tratamentos e terapias que promova.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium