Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Resumen

Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.

Resumen

La córnea es un tejido transparente que cubre el ojo y es crucial para una visión clara. Es el tejido más inervado del cuerpo. Esta inervación proporciona sensibilidad y función trófica al ojo y contribuye a preservar la integridad de la córnea. La alteración patológica de esta inervación se denomina queratitis neurotrófica. Esto puede desencadenarse por una lesión en el ojo, una cirugía o una enfermedad. En este estudio, proponemos tres protocolos diferentes para infligir daño a la inervación de manera que recapitulen los tres tipos de casos que generalmente se encuentran en la clínica.

El primer método consiste en realizar una abrasión del epitelio con una rebaba oftálmica. Esto implica la extirpación de la capa epitelial, las terminaciones nerviosas libres y el plexo subbasal de manera similar a la cirugía de queratectomía fotorrefractiva realizada en la clínica. El segundo método solo se dirige a la inervación seccionándola en la periferia con un punzón de biopsia, manteniendo la integridad del epitelio. Este método es similar a los primeros pasos de la queratoplastia lamelar y conduce a una degeneración de la inervación seguida de un nuevo crecimiento de los axones en la córnea central. El último método daña la inervación de un modelo de ratón transgénico utilizando un microscopio multifotónico, que localiza específicamente el sitio de cauterización de las fibras nerviosas fluorescentes. Este método inflige el mismo daño que la fotoqueratitis, una sobreexposición a la luz ultravioleta.

Este estudio describe diferentes opciones para investigar la fisiopatología de la inervación corneal, en particular la degeneración y regeneración de los axones. Promover la regeneración es crucial para evitar complicaciones como defectos epiteliales o incluso la perforación de la córnea. Los modelos propuestos pueden ayudar a probar nuevas moléculas farmacológicas o terapia génica que mejoren la regeneración nerviosa y limiten la progresión de la enfermedad.

Introducción

La córnea, que es la superficie transparente del ojo, está compuesta por tres capas distintas: el epitelio, el estroma y el endotelio. Este órgano tiene la mayor densidad de inervación del cuerpo y está compuesto principalmente por fibras sensoriales (tipos Aδ y C) que se originan en la rama oftálmica del ganglio del trigémino. Las fibras sensoriales penetran en la periferia de la córnea en el estroma medio en forma de grandes haces que se ramifican para cubrir la superficie. Luego se bifurcan para perforar la membrana de Bowmann y formar el plexo subbasal, que es fácilmente reconocible por la formación de un vórtice en el centro de la córnea. Esas fibras terminan como terminaciones nerviosas libres en la superficie externa del epitelio. Son capaces de transducir estímulos térmicos, mecánicos y químicos y de liberar factores tróficos que son esenciales para la homeostasis del epitelio ^1,2. La queratitis neurotrófica (NK) es una enfermedad degenerativa que afecta a la inervación sensorial corneal. Esta enfermedad rara se deriva de una disminución o pérdida de la sensibilidad corneal que se traduce en una menor producción de lágrimas y malas propiedades curativas de la córnea³. La NK progresa a través de tres estadios bien descritos, desde el estadio 1, en el que los pacientes sufren defectos epiteliales, hasta el estadio 3, en el que se produce la fusión del estroma y/o la perforación de la córnea⁴.

Clínicamente, los orígenes de esta enfermedad pueden ser diversos. Los pacientes pueden perder la inervación corneal después de una lesión física en el ojo, una cirugía o a través de enfermedades crónicas, como la diabetes ^5,6. Hasta la fecha, el proceso de patogénesis de NK sigue siendo poco conocido, y las opciones terapéuticas para esta afección que amenaza la vista son muy limitadas. Por lo tanto, se necesita una mejor comprensión de las características de los defectos epiteliales para comprender mejor los mecanismos detrás de la regeneración de esas fibras y potencialmente promoverlos. Aquí, proponemos varios modelos de lesión corneal que inducen NK en ratones.

El primer modelo es la abrasión de la capa epitelial de la córnea con una rebaba ocular. Este modelo ha sido estudiado principalmente en el contexto de la regeneración del epitelio en diferentes animales, como roedores y peces ^7,8,9, y para probar moléculas que promueven la cicatrización corneal^10,11. Fisiológicamente, las células epiteliales tardan entre 2 y 3 días en cerrar la herida. El patrón fisiológico de la inervación, sin embargo, tarda más de cuatro semanas en recuperarse de la abrasión^12,13. Durante la cirugía, la rebaba ocular elimina la capa epitelial de la córnea que contiene el plexo subbasal y las terminaciones nerviosas libres de las fibras. Este procedimiento se puede comparar clínicamente con pacientes con queratectomía fotorrefractiva (PRK) para corregir defectos refractivos oculares. El procedimiento consiste en extirpar el epitelio de la córnea y luego remodelar el estroma con un láser¹⁴. Los pacientes pueden experimentar varios efectos secundarios después de dicha cirugía, como una disminución de la densidad del nervio corneal durante 2 años y una reducción de la sensibilidad durante un período de 3 meses a un año después de la cirugía¹⁵. Dado que la cirugía induce una fragilidad del microambiente corneal, este modelo podría ayudar a investigar estos efectos secundarios y desarrollar enfoques terapéuticos que promuevan una reinervación más rápida, reduciendo así los efectos secundarios en cuestión.

El segundo modelo consiste en seccionar los axones en la periferia de la córnea con un punzón de biopsia, induciendo una degeneración walleriana de la inervación central ¹⁶. Clínicamente, este método podría compararse con la queratoplastia lamelar anterior, en la que el cirujano realiza una trepanación parcial de la córnea para eliminar una parte del grosor anterior de la córnea y reemplazarla con un trasplante de donante ¹⁷. Después de la queratoplastia lamelar, los pacientes pueden sufrir una serie de síntomas que incluyen ojo seco, pérdida de inervación corneal y rechazo del injerto¹⁸. Este modelo de axotomía realizado en los nervios corneales podría proporcionar información sobre los mecanismos de degeneración de las fibras, que ocurre después de un injerto, seguido de la regeneración de los axones.

El tercer método daña los nervios corneales con un láser. Mediante el uso de un microscopio multifotónico en la córnea de animales anestesiados, se induce la degeneración de los nervios localizados en el campo óptico como resultado de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que conduce al daño del ADN y a la cavitación celular¹⁹. Este método recapitula el fotodaño corneal inducido por la sobreexposición a los rayos UV naturales (quemaduras solares), que también desencadena la formación de ROS, lo que conduce a daños en el ADN²⁰. Los pacientes que sufren quemaduras solares en la córnea experimentan un gran dolor, ya que el deterioro de las células epiteliales priva a las extremidades de las fibras corneales de todo.

Los tres métodos aquí descritos están diseñados para permitir la investigación del proceso de patogénesis NK y la regeneración de axones. Son fácilmente reproducibles y precisos. Además, permiten una rápida recuperación y un fácil seguimiento de los animales.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta Nacional de Experimentos con Animales.

1. Preparativos

1. Prepare una solución anestésica de ketamina-xilacina para la anestesia. Inyectar ketamina a 80 mg/kg y xilacina a 10 mg/kg diluyendo 200 μL de ketamina (100 mg/mL) y 125 μL de xilacina (20 mg/mL) en 2.175 mL de NaCl estéril al 0,9%.
2. Preparar 0,02 mg/ml de solución de buprenorfina como solución analgésica añadiendo 100 μl de buprenorfina 0,3 mg/ml a 1.400 ml de NaCl estéril al 0,9%.
3. Prepare la solución de tinción fluorescente.
   1. Utilice una báscula fina para pesar 10 mg de sal de fluoresceína y dilúyala en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una solución de fluoresceína al 0,1%.
   2. Proteja la solución de la luz y agítela durante 5 min. Utilice una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,2 μm para filtrar la solución.
      NOTA: La solución fluorescente debe protegerse de la luz y puede almacenarse a +4 °C durante 5 días.
4. Preparación del ratón
   1. Pesar al ratón e inducir la anestesia realizando una inyección intraperitoneal de 10 μL/g de peso del ratón (MW) de la solución anestésica. Cuando el ratón deje de moverse, colóquelo sobre una placa calefactada (37 °C) y verifique que esté completamente anestesiado pellizcando los dedos de los pies.
   2. Aplicar una gota de lágrima artificial en el ojo sometido a la cirugía y una gota de gel ocular en el ojo contralateral.
   3. Una vez que el ratón no responda al pellizco, inyecte la analgesia (0,02 mg/ml de buprenorfina) a 5 μl/g de MW para proporcionar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello.

2. Abrasión de la córnea

1. Siga el paso 1.3 para preparar la solución de tinción fluorescente.
2. Siga el paso 1.4 para preparar el mouse.
3. Antes de realizar la abrasión, sumerja la rebaba ocular en EtOH al 70% y luego en PBS para limpiarla.
4. Coloque el ratón en una placa calefactada (37 °C) en el lateral para acceder fácilmente al ojo sometido a la cirugía.
   1. Use un hisopo de algodón para absorber la lágrima artificial y cepille las pestañas sin tocar el ojo.
   2. Encienda la fresa ocular, abra el párpado del ratón con dos dedos y, al mismo tiempo, bloquee las vibrisas para evitar que se atasquen en la fresa.
5. Localiza la pupila o el centro del ojo y aplica la rebaba ocular en la superficie del ojo, y haz movimientos circulares. Al mirar de cerca, se puede observar la superficie del epitelio eliminado. De lo contrario, realice aproximadamente 20 movimientos circulares sobre la córnea.
6. Vuelva a colocar al ratón boca abajo y compruebe si el gel ocular sigue presente en el ojo contralateral.
7. Aplique una gota de solución de tinción fluorescente sobre el ojo desgastado y espere 20 s. Absorber la gota con un pañuelo de papel sin tocar el ojo y enjuagarla con una gota de lágrima artificial. Absorbe la gota de la lágrima artificial con un pañuelo de papel e ilumina el ojo con la lámpara azul cobalto.
   NOTA: La abrasión tiene que tener una forma circular. Se requiere cierto entrenamiento para obtenerlo.
8. Aplique una gota de gel ocular en el ojo desgastado y deje que el ratón se despierte en la almohadilla térmica. Cuando el ratón se mueva por sí solo, vuelve a colocarlo en su jaula.
9. Comprobar el bienestar del animal durante los 2 días siguientes.
10. Después del uso de la fresa ocular, use un tejido blando para eliminar las células epiteliales adheridas en la cabeza de la fresa y sumérjala en EtOH al 70% y luego PBS.
    NOTA: Una vez que se hayan eliminado las células epiteliales con el tejido blando, asegúrese de que no queden trozos de tejido atascados en la cabeza de la fresa.

3. Axotomía de los nervios corneales

1. Siga el paso 1.4 para preparar el mouse.
2. Coloque el ratón debajo de una lupa binocular en el costado para acceder al ojo que se va a someter a la cirugía. Coloque la parte inferior de una placa de Petri debajo de la cabeza del ratón para que el ojo quede horizontal.
   NOTA: Los siguientes pasos se realizarán mirando a través de la lupa binocular.
3. Retire la lágrima artificial con un bastoncillo de algodón y retire las pestañas sin tocar el ojo.
4. Coloque alicates curvos suaves debajo del ojo del animal para sacarlo de la órbita. Asegúrese de cerrar los alicates lo suficiente para que el ojo no pueda volver a la órbita una vez que se aplica presión, pero no excesivamente para evitar daños en el nervio óptico.
5. Aplicar el punzón de biopsia de 2,5 mm verticalmente sobre el ojo sin presión para asegurar el contacto total del punzón con la superficie de la córnea.
   NOTA: Una vez que se aplica el punzón contra la córnea, la mano del experimentador puede interferir con el campo de visión.
6. Luego, comience a aplicar presión y gire el punzón varias veces.
   NOTA: Dependiendo de la presión, el número de giros puede variar, pero generalmente es de alrededor de 5. Requiere entrenamiento para sentir la presión y el movimiento adecuados. Si se aplica demasiada presión, el ojo se rompe. En este caso, se puede observar que el líquido sale de la lesión y el ojo se ablanda. El animal tiene que ser sacrificado.
7. Retire el punzón de biopsia. Debe haber un círculo visible en la córnea donde se aplicó la punción de biopsia.
   NOTA: Los siguientes pasos no requieren la lupa binocular.
8. Compruebe si el ojo contralateral todavía tiene gel ocular y aplique un poco sobre el ojo axotomizado.
9. Deje que el ratón se despierte en una almohadilla térmica (37 °C) y vuelva a colocarlo en su jaula cuando se mueva por sí solo.
10. Comprobar el bienestar del animal durante los 2 días siguientes.

4. Procesamiento de montaje completo de la córnea

1. Recogida y fijación de muestras.
   1. Pesar al ratón e inducir la anestesia realizando una inyección intraperitoneal de 10 μL/g de peso del ratón (MW) de la solución anestésica.
   2. Cuando el ratón deje de moverse y no tenga reflejos al pellizcarse los dedos de los pies, realice una luxación cervical.
   3. Saca el ojo de la órbita con dos dedos y enuclea el ojo cortando el nervio óptico con unas tijeras curvas.
   4. Coloque el ojo en un tubo de plástico de 2 ml que contenga PBS.
   5. Fije el ojo reemplazando el PBS con paraformaldehído al 4% y colocándolo en un agitador (30 rpm) a temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
   6. Enjuague 3 veces durante 10 minutos con PBS a RT en una coctelera (30 rpm).
2. Disección de la córnea
   1. Coloque una gota de PBS en un trozo de parafilm dentro de una placa de Petri.
   2. Coloque el ojo en esta gota de PBS.
   3. Coloque la placa de Petri debajo de la lupa binocular.
   4. Disecciona la córnea con tijeras de microdisección y fórceps. Cortar por encima del cuerpo ciliar para mantener el limbo.
   5. Retire el cristalino, el cuerpo ciliar y el iris con pinzas finas.
   6. Vuelva a colocar la córnea en un tubo de plástico de 2 ml.
3. Protocolo de inmunofluorescencia
   1. Incubar la córnea en 2 ml de gelatina de piel de pescado al 2,5%, suero de cabra al 5% y detergente al 0,5% en PBS durante 1 h a RT en un agitador (30 rpm).
   2. Incubar la córnea en 150 μL de una solución de gelatina de piel de pescado al 2,5%, suero de cabra al 5% y detergente al 0,1% en PBS que contenga el anticuerpo primario diluido a 1/1000 (anticuerpo anti βIII tubulina) durante la noche a 4 °C en un agitador (30 rpm).
   3. Enjuague 3 veces durante 1 h con detergente al 0,1% en PBS a RT en un agitador (30 rpm).
   4. Incubar la córnea en la misma solución que en el paso 4.3.2, que contiene el anticuerpo secundario diluido a 1/500 durante la noche a 4 °C en un agitador (30 rpm).
   5. Enjuague 3 veces durante 1 h con PBS a RT en una coctelera (30 rpm).
   6. Incubar la córnea durante 10 min con 150 μL de intercalador de ADN diluido a 1/5000 a RT en un agitador (30 rpm).
   7. Enjuague 2 veces durante 5 minutos con PBS.
4. Montaje de la córnea
   1. Coloque la córnea en un portaobjetos, con el epitelio orientado hacia el portaobjetos, y use un bisturí para crear cuatro secciones sin llegar al centro.
      NOTA: Haz las secciones opuestas entre sí para formar una forma de flor.
   2. Coloque el endotelio de la córnea hacia el portaobjetos y retire el PBS alrededor de la córnea con un pañuelo de papel.
      NOTA: No retire el PBS debajo de la córnea; de lo contrario, pueden aparecer burbujas de aire. Si es así, agregue PBS a la córnea y retire la burbuja de aire. A continuación, reinicie desde el paso 4.3.2.
   3. Agregue pasta de modelo en las cuatro esquinas de un cubreobjetos rectangular.
      NOTA: La pasta modelo eleva el cubreobjetos ya que la córnea es un tejido grueso.
   4. Deje caer 50 μL de un medio de montaje sobre la córnea y coloque con cuidado el cubreobjetos por encima para evitar la formación de burbujas.
   5. Sella el cubreobjetos con esmalte de uñas.
5. Imagenológico
   1. Coloque el portaobjetos bajo un microscopio epifluorescente.
   2. Defina el tamaño del mosaico y la profundidad de la imagen e inicie la adquisición.
   3. Aplique un programa de desenfoque y deconvolución en la imagen adquirida.
      NOTA: El paso 4.6.3 es una opción seleccionada en el software de adquisición (Large Volume Computational Clearing [LVCC])

5. Ablación localizada con láser de los nervios corneales

1. Encienda el microscopio multifotónico vertical y el láser combinado con un oscilador óptico paramétrico. Active la platina calentada del microscopio (37 °C) y ajuste los láseres a 850 nm y 1100 nm, correspondientes a las longitudes de onda requeridas para el modelo de ratón.
2. Utilice un medidor de potencia para ajustar la potencia de los láseres simultáneamente a unos 20 mW.
3. Siga el paso 1.4 para preparar el ratón y aplique gel ocular en ambos ojos.
   NOTA: El animal utilizado para este protocolo debe ser de una línea de ratón transgénico (ratón transgénico MAGIC-Marker²¹) que exprese un fluoróforo endógeno en las fibras nerviosas corneales.
4. Instale el animal en un soporte para la cabeza. Gira el animal 90° para que el ojo de interés mire hacia el techo.
5. Amarre las vibrisas del animal para despejar el área de los ojos. Amarre el cuerpo del animal para disminuir el movimiento de la cabeza inducido por la respiración.
6. Coloque un cubreobjetos circular en el ojo por encima del gel ocular. El cubreobjetos tiene que ser horizontal. No dude en mover la cabeza del animal para que el cubreobjetos quede correctamente colocado.
7. Agregue una gota de PBS sobre el cubreobjetos. Coloque al animal en la platina del microscopio con cuidado y coloque la torreta del objetivo a la distancia correcta.
8. Utilice el objetivo acuoso de 20x y la epifluorescencia para localizar el ojo y la inervación a través del ocular.
9. Activa los láseres y define la profundidad que hay que iluminar.
10. Adquiera imágenes de 1024 x 1024 (píxeles) a una velocidad de adquisición del 70 % al 85 % de la velocidad máxima de escaneo.
11. Una vez adquirida la imagen, se retira al animal del microscopio y se le quitan el cubreobjetos y las correas. Retire al animal del soporte para la cabeza, agregue más gel ocular si es necesario y deje que se despierte en una jaula sobre un plato caliente.
    NOTA: La destrucción de la inervación se puede observar 1 semana después de la toma de imágenes. Este protocolo se puede repetir una vez a la semana durante varias semanas para aumentar el daño causado por los láseres.
12. Cuando el animal se mueva por sí solo, vuelva a colocar la jaula en el establo y verifique su bienestar durante los siguientes 2 días.

Resultados

Este estudio propone varios protocolos para infligir daño a la inervación corneal en ratones. Si bien se han utilizado protocolos similares para investigar la fisiopatología de la cicatrización del epitelio, optamos por adaptar y desarrollar nuevos métodos para investigar la regeneración de la inervación corneal. Para observar la inervación, se utilizaron dos técnicas. En primer lugar, empleamos una técnica de inmunofluorescencia para teñir las fibras nerviosas utilizando un anticuerpo panneuronal (tubulina BI...

Discusión

La queratitis neurotrófica se considera una enfermedad rara que afecta a 5 de cada 10.000 personas. Sin embargo, las personas que padecen NK debido a una lesión física como quemaduras químicas, o síndromes como la diabetes o la esclerosis múltiple no se incluyen en esas estadísticas³. Además, esta condición sigue estando significativamente infradiagnosticada²² y la prevalencia de la enfermedad está subestimada. Existe una gran necesidad de nuevos tratamientos y te...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium