Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Resumen

Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.

Resumen

La córnea es un tejido transparente que cubre el ojo y es crucial para una visión clara. Es el tejido más inervado del cuerpo. Esta inervación proporciona sensibilidad y función trófica al ojo y contribuye a preservar la integridad de la córnea. La alteración patológica de esta inervación se denomina queratitis neurotrófica. Esto puede desencadenarse por una lesión en el ojo, una cirugía o una enfermedad. En este estudio, proponemos tres protocolos diferentes para infligir daño a la inervación de manera que recapitulen los tres tipos de casos que generalmente se encuentran en la clínica.

El primer método consiste en realizar una abrasión del epitelio con una rebaba oftálmica. Esto implica la extirpación de la capa epitelial, las terminaciones nerviosas libres y el plexo subbasal de manera similar a la cirugía de queratectomía fotorrefractiva realizada en la clínica. El segundo método solo se dirige a la inervación seccionándola en la periferia con un punzón de biopsia, manteniendo la integridad del epitelio. Este método es similar a los primeros pasos de la queratoplastia lamelar y conduce a una degeneración de la inervación seguida de un nuevo crecimiento de los axones en la córnea central. El último método daña la inervación de un modelo de ratón transgénico utilizando un microscopio multifotónico, que localiza específicamente el sitio de cauterización de las fibras nerviosas fluorescentes. Este método inflige el mismo daño que la fotoqueratitis, una sobreexposición a la luz ultravioleta.

Este estudio describe diferentes opciones para investigar la fisiopatología de la inervación corneal, en particular la degeneración y regeneración de los axones. Promover la regeneración es crucial para evitar complicaciones como defectos epiteliales o incluso la perforación de la córnea. Los modelos propuestos pueden ayudar a probar nuevas moléculas farmacológicas o terapia génica que mejoren la regeneración nerviosa y limiten la progresión de la enfermedad.

Introducción

La córnea, que es la superficie transparente del ojo, está compuesta por tres capas distintas: el epitelio, el estroma y el endotelio. Este órgano tiene la mayor densidad de inervación del cuerpo y está compuesto principalmente por fibras sensoriales (tipos Aδ y C) que se originan en la rama oftálmica del ganglio del trigémino. Las fibras sensoriales penetran en la periferia de la córnea en el estroma medio en forma de grandes haces que se ramifican para cubrir la superficie. Luego se bifurcan para perforar la membrana de Bowmann y formar el plexo subbasal, que es fácilmente reconocible por la formación de un vórtice en el centro de la córnea. Esas fibras terminan com....

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta Nacional de Experimentos con Animales.

1. Preparativos

1. Prepare una solución anestésica de ketamina-xilacina para la anestesia. Inyectar ketamina a 80 mg/kg y xilacina a 10 mg/kg diluyendo 200 μL de ketamina (100 mg/mL) y 125 μL de xilacina (20 mg/mL) en 2.175 mL de NaCl estéril al 0,9%.
2. Preparar 0,02 mg/ml de solución de buprenorfina como solución analgésica añadiendo 100 μl de buprenorfina 0,3 mg/ml a 1.400 ml de NaCl estéril al 0,9%.
3. Prepare la solución de tinción fluorescente.
   1. Utilice una báscula fina para pesar 10 mg de sa....

Discusión

La queratitis neurotrófica se considera una enfermedad rara que afecta a 5 de cada 10.000 personas. Sin embargo, las personas que padecen NK debido a una lesión física como quemaduras químicas, o síndromes como la diabetes o la esclerosis múltiple no se incluyen en esas estadísticas³. Además, esta condición sigue estando significativamente infradiagnosticada²² y la prevalencia de la enfermedad está subestimada. Existe una gran necesidad de nuevos tratamientos y te.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium