שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

Summary

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

Abstract

הקרנית היא רקמה שקופה המכסה את העין והיא חיונית לראייה ברורה. זוהי הרקמה העצבנית ביותר בגוף. עצבוב זה מספק תחושה ותפקוד טרופי לעין ותורם לשמירה על שלמות הקרנית. השיבוש הפתולוגי של עצבוב זה נקרא קרטיטיס נוירוטרופית. זה יכול להיות מופעלות על ידי פגיעה בעין, ניתוח, או מחלה. במחקר זה, אנו מציעים שלושה פרוטוקולים שונים לגרימת נזק לעצבוב בדרכים המשחזרות את שלושת סוגי המקרים בהם נתקלים בדרך כלל במרפאה.

השיטה הראשונה מורכבת בביצוע שחיקה של אפיתל עם בור אופתלמי. מדובר בהסרת שכבת האפיתל, קצות העצבים החופשיים והמקלעת התת-בזאלית באופן דומה לניתוח כריתת קרניים פוטו-רפרקטיבי המבוצע במרפאה. השיטה השנייה מכוונת לעצבוב רק על ידי חתיכתו בפריפריה עם ניקוב ביופסיה, תוך שמירה על שלמות האפיתל. שיטה זו דומה לשלבים הראשונים של קרטופלסטיקה למלרית ומובילה לניוון של העצבוב ואחריו צמיחה מחודשת של האקסונים בקרנית המרכזית. השיטה האחרונה פוגעת בעצבוב של מודל עכבר מהונדס באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון, אשר ממקם באופן ספציפי את אתר הצריבה של סיבי העצב הפלואורסצנטיים. שיטה זו גורמת לאותו נזק כמו פוטוקרטיטיס, חשיפת יתר לאור UV.

מחקר זה מתאר אפשרויות שונות לחקר הפיזיופתולוגיה של עצבוב הקרנית, במיוחד הניוון וההתחדשות של האקסונים. קידום התחדשות הוא חיוני למניעת סיבוכים כגון פגמים אפיתל או אפילו ניקוב של הקרנית. המודלים המוצעים יכולים לסייע בבדיקת מולקולות פרמקולוגיות חדשות או ריפוי גנטי המשפרים את התחדשות העצבים ומגבילים את התקדמות המחלה.

Introduction

הקרנית, שהיא פני השטח השקופים של העין, מורכבת משלוש שכבות נפרדות: האפיתל, הסטרומה והאנדותל. לאיבר זה יש את צפיפות העצבוב הגבוהה ביותר בגוף והוא מורכב בעיקר מסיבי חישה (סוגים Aδ ו- C) שמקורם בענף העיניים של הגנגליון הטריגמינלי. סיבי החישה חודרים לשולי הקרנית באמצע הסטרומה בצורה של צרורות גדולים המסתעפים החוצה כדי לכסות את פני השטח. לאחר מכן הם מתפצלים כדי לחדור את קרום באומן וליצור את המקלעת התת-בסיסית, אשר ניתנת לזיהוי בקלות על ידי היווצרות מערבולת במרכז הקרנית. סיבים אלה מסתיימים כקצות עצבים חופשיים על פני השטח החיצוניים של האפיתל. הם מסוגלים להמיר גירויים תרמיים, מכניים וכימיים ולשחרר גורמים טרופיים החיוניים להומאוסטזיס^{אפיתל 1,2}. Neurotrophic keratitis (NK) היא מחלה ניוונית המשפיעה על עצבוב חושי הקרנית. מחלה נדירה זו נובעת מירידה או אובדן רגישות בקרנית הגורמת לייצור דמעות נמוך יותר ולתכונות ריפוי לקויות של הקרנית³. NK מתקדם דרך שלושה שלבים המתוארים היטב, משלב 1 שבו חולים סובלים ממומים אפיתליאליים, לשלב 3 שבו סטרומה נמסה ו / או ניקוב הקרנית להתרחש⁴.

מבחינה קלינית, מקורותיה של מחלה זו יכולים להיות מגוונים. חולים יכולים לאבד עצבוב הקרנית לאחר פגיעה פיזית בעין, ניתוח, או באמצעות מחלות כרוניות, כגון סוכרת ^5,6. עד כה, תהליך הפתוגנזה של NK נותר מובן היטב, והאפשרויות הטיפוליות למצב מסכן ראייה זה מוגבלות מאוד. לכן, יש צורך בהבנה טובה יותר של המאפיינים של פגמים אפיתליאליים כדי להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים מאחורי התחדשות סיבים אלה ולקדם אותם. כאן, אנו מציעים מספר מודלים של פגיעה בקרנית הגורמת NK בעכברים.

המודל הראשון הוא שחיקה של שכבת האפיתל של הקרנית עם בור העין. מודל זה נחקר בעיקר בהקשר של התחדשות האפיתל בבעלי חיים שונים, כגון מכרסמים ודגים ^7,8,9, וכדי לבדוק מולקולות המקדמות ריפוי קרנית^10,11. מבחינה פיזיולוגית, לוקח 2-3 ימים לתאי האפיתל לסגור את הפצע. הדפוס הפיזיולוגי של העצבוב, לעומת זאת, לוקח יותר מארבעה שבועות להתאושש מהשחיקה^12,13. במהלך הניתוח, בור העין מסיר את שכבת האפיתל של הקרנית המכילה את המקלעת התת-בזאלית ואת קצות העצבים החופשיים של הסיבים. הליך זה ניתן להשוות קלינית לחולים עם keratectomy photorefractive (PRK) כדי לתקן פגמים שבירה בעין. ההליך מורכב מהסרת האפיתל של הקרנית ולאחר מכן עיצוב מחדש של הסטרומה עם לייזר¹⁴. חולים יכולים לחוות מספר תופעות לוואי לאחר ניתוח כזה, כגון ירידה בצפיפות עצב הקרנית למשך שנתיים וירידה ברגישות למשך 3 חודשים עד שנה לאחר הניתוח¹⁵. בהתחשב בכך שהניתוח גורם לשבריריות של מיקרו-סביבה בקרנית, מודל זה יכול לסייע לחקור תופעות לוואי אלה ולפתח גישות טיפוליות שיקדמו עצבוב מחדש מהיר יותר, ובכך להפחית את תופעות הלוואי המדוברות.

המודל השני מורכב מחיתוך האקסונים בשולי הקרנית באמצעות ניקוב ביופסיה, הגורם לניוון וולרי של העצבוב המרכזי ¹⁶. מבחינה קלינית, ניתן להשוות שיטה זו לקרטופלסטיקה למלרית קדמית, שבה המנתח מבין טרפינציה חלקית של הקרנית כדי להסיר חלק מהעובי הקדמי של הקרנית ולהחליפו בהשתלת תורם ¹⁷. לאחר קרטופלסטיקה למלרית, חולים עלולים לסבול ממספר תסמינים, כולל עין יבשה, אובדן עצבוב הקרנית ודחיית השתל¹⁸. מודל אקסוטומיה זה המבוצע על עצבי הקרנית יכול לספק תובנה לגבי מנגנוני ניוון הסיבים, המתרחש לאחר השתלה, ואחריה התחדשות האקסונים.

השיטה השלישית פוגעת בעצבי הקרנית באמצעות לייזר. על ידי שימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון על הקרנית של בעלי חיים מורדמים, ניוון העצבים הממוקמים בשדה האופטי מושרה כתוצאה מהיווצרות מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שמוביל לנזק לדנ"א ולקוויטציה תאית¹⁹. שיטה זו משחזרת את נזקי האור של הקרנית הנגרמים על ידי חשיפת יתר לקרינת UV טבעית (כוויות שמש), אשר גם מפעילה היווצרות ROS, מה שמוביל לנזק לדנ"א²⁰. חולים הסובלים מכוויות שמש בקרנית חווים כאב רב, שכן הידרדרות תאי האפיתל שוללת את הגפיים של סיבי הקרנית מכל.

שלוש השיטות המתוארות כאן נועדו לאפשר חקירה של תהליך הפתוגנזה NK והתחדשות אקסונים. הם ניתנים לשחזור ומדויקים בקלות. יתר על כן, הם מאפשרים התאוששות מהירה וניטור קל של בעלי החיים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים.

1. הכנות

1. הכינו תמיסת הרדמה של קטמין-קסילזין להרדמה. הזריקו קטמין ב-80 מ"ג/ק"ג וקסילזין ב-10 מ"ג/ק"ג על ידי דילול 200 מיקרוליטר קטמין (100 מ"ג/מ"ל) ו-125 מיקרוליטר קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) ב-2,175 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
2. הכינו תמיסת בופרנורפין 0.02 מ"ג/מ"ל כתמיסה משככת כאבים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין ל-1,400 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
3. הכינו את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.
   1. השתמש במשקל עדין כדי לשקול 10 מ"ג של מלח פלואורסצאין ולדלל אותו ב -10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לקבל תמיסת פלואורסצאין 0.1%.
   2. הגן על התמיסה מפני האור ונער אותה במשך 5 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון.
      הערה: התמיסה הפלואורסצנטית צריכה להיות מוגנת מפני האור וניתן לאחסן אותה ב +4 ° C למשך 5 ימים.
4. הכנת העכבר
   1. משקל העכבר והשראת הרדמה על ידי ביצוע הזרקה תוך צפקית של 10 μL/g של משקל עכבר (MW) של תמיסת ההרדמה. כאשר העכבר מפסיק לנוע, הניחו אותו על צלחת מחוממת (37°C) וודאו שהוא מורדם לחלוטין על ידי צביטת אצבעות רגליו.
   2. יש למרוח טיפת דמעה מלאכותית על העין העוברת את הניתוח וטיפת ג'ל עיני על העין הנגדית.
   3. ברגע שהעכבר אינו מגיב לצביטה, הזריקו את משככי הכאבים (0.02 מ"ג / מ"ל בופרנורפין) ב 5 מיקרוליטר / גרם של MW כדי לספק 0.1 מ"ג / ק"ג buprenorphine תת עורית בצוואר.

2. שחיקה של הקרנית

1. בצע את שלב 1.3 כדי להכין את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.
2. בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר.
3. לפני ביצוע השחיקה, טבלו את בור העין ב-70% EtOH ולאחר מכן ב-PBS כדי לנקות אותו.
4. הניחו את העכבר על צלחת מחוממת (37°C) בצד כדי לגשת בקלות לעין העוברת את הניתוח.
   1. השתמשו בצמר גפן כדי לספוג את הדמעה המלאכותית ולהבריש את הריסים מבלי לגעת בעין.
   2. הפעל את בור העין, פתח את עפעף העכבר בשתי אצבעות, ובו זמנית לחסום את הוויבריסה כדי למנוע מהם להיתקע לתוך הבור.
5. למקם את האישון או את מרכז העין ולהחיל את בור העין על פני העין, ולעשות תנועות מעגליות. על ידי התבוננות מקרוב, פני השטח של אפיתל שהוסר ניתן לראות. אחרת, לעשות בערך 20 תנועות מעגליות על הקרנית.
6. החזירו את העכבר לבטנו ובדקו אם ג'ל העין עדיין קיים בעין הנגדית.
7. יש למרוח טיפה של תמיסת כתמים פלואורסצנטית על העין הנטועה ולהמתין 20 שניות. יש לספוג את הטיפה עם טישו מבלי לגעת בעין ולשטוף אותה בטיפת דמעה מלאכותית. לספוג את טיפת הדמעה המלאכותית עם רקמה ולהאיר את העין עם מנורת קובלט כחולה.
   הערה: השחיקה חייבת להיות בעלת צורה מעגלית. זה דורש קצת הכשרה כדי להשיג את זה.
8. החל טיפה של ג'ל העין abraded ולתת העכבר להתעורר על כרית מחוממת. כאשר העכבר נע בכוחות עצמו, החזירו אותו לכלוב שלו.
9. בדוק את רווחתו של בעל החיים במהלך היומיים הבאים.
10. לאחר השימוש בבור העין, השתמש ברקמה רכה כדי להסיר תאי אפיתל תקועים בראש הבור וטבול אותו ב 70% EtOH ולאחר מכן PBS.
    הערה: לאחר הסרת תאי האפיתל עם הרקמה הרכה, ודא כי לא נתקעו פיסות רקמה בראש הבור.

3. אקסוטומיה של עצבי הקרנית

1. בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר.
2. הניחו את העכבר מתחת לזכוכית מגדלת דו-עינית בצד כדי לגשת לעין העוברת את הניתוח. שים את החלק התחתון של צלחת פטרי מתחת לראש העכבר כדי שהעין תהיה אופקית.
   הערה: השלבים הבאים יבוצעו על ידי התבוננות דרך זכוכית מגדלת דו-עינית.
3. הסירו את הדמעה המלאכותית בעזרת צמר גפן והסירו את הריסים מבלי לגעת בעין.
4. מניחים צבת חלקה ומעוקלת מתחת לעין החיה כדי להוציא אותה מהמסלול. הקפד לסגור את הצבת מספיק כדי שהעין לא תוכל לחזור למסלול ברגע שיופעל לחץ, אך לא יתר על המידה כדי למנוע נזק לעצב הראייה.
5. החל את ניקוב הביופסיה של 2.5 מ"מ אנכית על העין ללא לחץ כדי להבטיח מגע מוחלט של האגרוף עם פני השטח של הקרנית.
   הערה: ברגע שהאגרוף מופעל על הקרנית, ידו של הנסיין עלולה להפריע לשדה הראייה.
6. לאחר מכן, התחל להפעיל לחץ ולסובב את האגרוף מספר פעמים.
   הערה: בהתאם ללחץ, מספר הפיתולים עשוי להשתנות, אך בדרך כלל הוא סביב 5. זה דורש אימון כדי להרגיש את הלחץ והתנועה הנכונים. אם מופעל לחץ רב מדי, העין נקרעת. במקרה זה, ניתן לראות נוזלים יוצאים מהנגע והעין מתרככת. צריך להקריב את החיה.
7. הסר את אגרוף הביופסיה. עיגול חייב להיות גלוי על הקרנית שבה הוחל אגרוף הביופסיה.
   הערה: השלבים הבאים אינם דורשים זכוכית מגדלת דו-עינית.
8. בדוק אם לעין הנגדית עדיין יש ג'ל עיני ולמרוח קצת על העין האקסונמית.
9. תן לעכבר להתעורר על כרית מחוממת (37 מעלות צלזיוס) והחזיר אותו לכלוב שלו כשהוא נע בכוחות עצמו.
10. בדוק את רווחתו של בעל החיים במהלך היומיים הבאים.

4. עיבוד הקרנית בהרכבה מלאה

1. איסוף דוגמאות וקיבוע.
   1. לשקול את העכבר ולגרום להרדמה על ידי ביצוע הזרקה intraperitoneal של 10 μL / g של משקל העכבר (MW) של פתרון ההרדמה.
   2. כאשר העכבר מפסיק לזוז ואין לו רפלקסים על ידי צביטת בוהן, בצע נקע צוואר הרחם.
   3. להוציא את העין מהמסלול באמצעות שתי אצבעות ולחנך את העין על ידי חיתוך עצב הראייה באמצעות מספריים מעוקלים.
   4. הניחו את העין בצינור פלסטיק בנפח 2 מ"ל המכיל PBS.
   5. תקן את העין על ידי החלפת PBS עם 4% paraformaldehyde והניח אותו על שייקר (30 סל"ד) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.
   6. יש לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות עם PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
2. דיסקציה של הקרנית
   1. מניחים טיפה של PBS על חתיכת פרפילם בתוך צלחת פטרי.
   2. הניחו את העין בטיפה זו של PBS.
   3. מניחים את צלחת הפטרי מתחת לזכוכית מגדלת דו-עינית.
   4. לנתח את הקרנית באמצעות מספריים microdissection ומלקחיים. חותכים מעל הגוף הרירי כדי לשמור על הלימבוס.
   5. הסר את העדשה, את הגוף הרירי, ואת הקשתית עם מלקחיים עדינים.
   6. מחזירים את הקרנית לצינור פלסטיק בנפח 2 מ"ל.
3. פרוטוקול Immunofluorescence
   1. יש לדגור על הקרנית ב-2 מ"ל של 2.5% ג'לטין מעור דגים, 5% סרום עיזים ו-0.5% חומר ניקוי ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
   2. יש לדגור על הקרנית ב-150 מיקרוליטר של תמיסה של 2.5% ג'לטין מעור דגים, 5% סרום עיזים ו-0.1% חומר ניקוי ב-PBS המכיל את הנוגדן הראשוני המדולל ב-1/1000 (נוגדן אנטי βIII טובולין) למשך הלילה ב-4°C על שייקר (30 סל"ד).
   3. יש לשטוף 3 פעמים במשך שעה אחת עם חומר ניקוי 0.1% ב-PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
   4. לדגור על הקרנית באותה תמיסה כמו בשלב 4.3.2, המכיל את הנוגדן המשני מדולל ב 1/500 לילה ב 4 ° C על שייקר (30 סל"ד).
   5. יש לשטוף 3 פעמים במשך שעה עם PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).
   6. לדגור על הקרנית במשך 10 דקות עם 150 μL של אינטרקלטור DNA מדולל ב 1/5000 ב RT על שייקר (30 סל"ד).
   7. יש לשטוף פעמיים במשך 5 דקות עם PBS.
4. הרכבה של הקרנית
   1. הניחו את הקרנית על מגלשה, אפיתל פונה למגלשה, והשתמשו באזמל כדי ליצור ארבעה חלקים מבלי להגיע למרכז.
      הערה: בצע את המקטעים המנוגדים זה לזה כדי ליצור צורת פרח.
   2. הניחו את אנדותל הקרנית מול המגלשה והוציאו את PBS סביב הקרנית באמצעות רקמה.
      הערה: אין להסיר את PBS מתחת לקרנית; אחרת, בועות אוויר עשויות להופיע. אם כן, הוסיפו PBS לקרנית והסירו את בועת האוויר. לאחר מכן הפעל מחדש משלב 4.3.2.
   3. הוסיפו משחת דגם על ארבע פינות של מכסה מלבני.
      הערה: משחת הדגם מרימה את הכיסוי מכיוון שהקרנית היא רקמה עבה.
   4. יש לזרוק 50 μL של מדיום הרכבה על הקרנית ולהניח בזהירות את הכיסוי מעל כדי למנוע היווצרות בועות.
   5. יש לאטום את הכיסוי בלק.
5. דימות
   1. הניחו את המגלשה מתחת למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
   2. הגדר את גודל הפסיפס ואת עומק התמונה והתחל את הרכישה.
   3. החל תוכנית טשטוש ו deconvolution על התמונה שנרכשה.
      הערה: שלב 4.6.3 הוא אפשרות שנבחרה בתוכנת הרכישה (סליקה חישובית בנפח גדול [LVCC])

5. אבלציה לייזר מקומית של עצבי הקרנית

1. הפעל את מיקרוסקופ המולטיפוטון הזקוף ואת הלייזר בשילוב מתנד פרמטרי אופטי. הפעל את השלב המחומם של המיקרוסקופ (37 ° C) והגדר את הלייזרים על 850 ננומטר ו 1100 ננומטר, המתאים לאורכי הגל הנדרשים עבור מודל העכבר.
2. השתמש במד כוח כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים בו זמנית בסביבות 20 mW.
3. בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר ולהחיל ג'ל עיניים על שתי העיניים.
   הערה: בעל החיים המשמש לפרוטוקול זה חייב להיות מקו עכבר מהונדס (עכבר מהונדס^{MAGIC-Marker 21}) המבטא פלואורופור אנדוגני בסיבי עצב הקרנית.
4. התקן את בעל החיים במחזיק ראש. סובב את החיה ב -90 מעלות לעין המעניינת לפנות לתקרה.
5. חגור את הוויבריסה של החיה כדי לנקות את אזור העיניים. חגור את גוף החיה כדי להפחית את תנועת הראש הנגרמת על ידי נשימה.
6. הניחו כיסוי עגול על העין מעל ג'ל העין. תלוש הכיסוי צריך להיות אופקי. אל תהססו להזיז את ראש החיה כדי שהכיסוי ימוקם כראוי.
7. הוסף טיפה של PBS מעל תלוש הכיסוי. הניחו את בעל החיים על במת המיקרוסקופ בזהירות וקבעו את צריח המטרה במרחק הנכון.
8. השתמש במטרה מימית 20x ו epifluorescence כדי למקם את העין ואת העצבוב דרך העינית.
9. הפעל את הלייזרים והגדר את העומק שיש להאיר.
10. קבל תמונה של 1024 x 1024 (פיקסלים) במהירות רכישה של 70%-85% ממהירות הסריקה המרבית.
11. לאחר רכישת התמונה, הסירו את בעל החיים מהמיקרוסקופ והסירו את הכיסוי ואת הרצועות. הסר את בעל החיים ממחזיק הראש, הוסף עוד ג'ל עיניים במידת הצורך, ותן לו להתעורר בכלוב על צלחת מחוממת.
    הערה: הרס של העצבוב ניתן לראות 1 שבוע לאחר ההדמיה. ניתן לחזור על פרוטוקול זה פעם בשבוע למשך מספר שבועות כדי להגדיל את הנזק שנגרם על ידי הלייזרים.
12. כאשר החיה נעה בכוחות עצמה, להחזיר את הכלוב לאורווה ולבדוק את רווחתו במשך היומיים הבאים.

תוצאות

מחקר זה מציע מספר פרוטוקולים לגרימת נזק לעצבוב הקרנית בעכברים. בעוד פרוטוקולים דומים שימשו לחקר הפיזיופתולוגיה של ריפוי האפיתל, בחרנו להתאים ולפתח שיטות חדשות לחקר התחדשות עצבוב הקרנית. כדי להתבונן בעצבוב, השתמשנו בשתי טכניקות. ראשית, השתמשנו בטכניקת אימונופלואורסנציה כדי להכתים את סיב?...

Discussion

קרטיטיס נוירוטרופית נחשבת למחלה נדירה, המשפיעה על 5 מתוך 10,000 אנשים. עם זאת, אנשים הסובלים NK עקב פגיעה פיזית כגון כוויות כימיות, או תסמונות כגון סוכרת או טרשת נפוצה אינם נכללים בסטטיסטיקה זו³. יתר על כן, מצב זה עדיין מאובחן באופן משמעותי²², ושכיחות המחלה מוערכת בחסר. י...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium