A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

Abstract

הקרנית היא רקמה שקופה המכסה את העין והיא חיונית לראייה ברורה. זוהי הרקמה העצבנית ביותר בגוף. עצבוב זה מספק תחושה ותפקוד טרופי לעין ותורם לשמירה על שלמות הקרנית. השיבוש הפתולוגי של עצבוב זה נקרא קרטיטיס נוירוטרופית. זה יכול להיות מופעלות על ידי פגיעה בעין, ניתוח, או מחלה. במחקר זה, אנו מציעים שלושה פרוטוקולים שונים לגרימת נזק לעצבוב בדרכים המשחזרות את שלושת סוגי המקרים בהם נתקלים בדרך כלל במרפאה.

השיטה הראשונה מורכבת בביצוע שחיקה של אפיתל עם בור אופתלמי. מדובר בהסרת שכבת האפיתל, קצות העצבים החופשיים והמקלעת התת-בזאלית באופן דומה לניתוח כריתת קרניים פוטו-רפרקטיבי המבוצע במרפאה. השיטה השנייה מכוונת לעצבוב רק על ידי חתיכתו בפריפריה עם ניקוב ביופסיה, תוך שמירה על שלמות האפיתל. שיטה זו דומה לשלבים הראשונים של קרטופלסטיקה למלרית ומובילה לניוון של העצבוב ואחריו צמיחה מחודשת של האקסונים בקרנית המרכזית. השיטה האחרונה פוגעת בעצבוב של מודל עכבר מהונדס באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון, אשר ממקם באופן ספציפי את אתר הצריבה של סיבי העצב הפלואורסצנטיים. שיטה זו גורמת לאותו נזק כמו פוטוקרטיטיס, חשיפת יתר לאור UV.

מחקר זה מתאר אפשרויות שונות לחקר הפיזיופתולוגיה של עצבוב הקרנית, במיוחד הניוון וההתחדשות של האקסונים. קידום התחדשות הוא חיוני למניעת סיבוכים כגון פגמים אפיתל או אפילו ניקוב של הקרנית. המודלים המוצעים יכולים לסייע בבדיקת מולקולות פרמקולוגיות חדשות או ריפוי גנטי המשפרים את התחדשות העצבים ומגבילים את התקדמות המחלה.

Introduction

הקרנית, שהיא פני השטח השקופים של העין, מורכבת משלוש שכבות נפרדות: האפיתל, הסטרומה והאנדותל. לאיבר זה יש את צפיפות העצבוב הגבוהה ביותר בגוף והוא מורכב בעיקר מסיבי חישה (סוגים Aδ ו- C) שמקורם בענף העיניים של הגנגליון הטריגמינלי. סיבי החישה חודרים לשולי הקרנית באמצע הסטרומה בצורה של צרורות גדולים המסתעפים החוצה כדי לכסות את פני השטח. לאחר מכן הם מתפצלים כדי לחדור את קרום באומן וליצור את המקלעת התת-בסיסית, אשר ניתנת לזיהוי בקלות על ידי היווצרות מערבולת במרכז הקרנית. סיבים אלה מסתיימים כקצות עצבים חופשיים על פני השטח החיצוניים של האפיתל. הם מסוגלים להמיר גירויים תרמיים, מכניים וכימיים ולשחרר גורמים טרופיים החיוניים להומאוסטזיסאפיתל 1,2

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים.

1. הכנות

  1. הכינו תמיסת הרדמה של קטמין-קסילזין להרדמה. הזריקו קטמין ב-80 מ"ג/ק"ג וקסילזין ב-10 מ"ג/ק"ג על ידי דילול 200 מיקרוליטר קטמין (100 מ"ג/מ"ל) ו-125 מיקרוליטר קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) ב-2,175 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
  2. הכינו תמיסת בופרנורפין 0.02 מ"ג/מ"ל כתמיסה משככת כאבים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין ל-1,400 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
  3. הכינו את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.
    1. השתמש במשקל עדין כדי לשקול 10 מ"ג של מלח פלואורסצאין ולדלל אותו ב -10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לקבל תמיסת פלואורסצאין 0.1%....

תוצאות

מחקר זה מציע מספר פרוטוקולים לגרימת נזק לעצבוב הקרנית בעכברים. בעוד פרוטוקולים דומים שימשו לחקר הפיזיופתולוגיה של ריפוי האפיתל, בחרנו להתאים ולפתח שיטות חדשות לחקר התחדשות עצבוב הקרנית. כדי להתבונן בעצבוב, השתמשנו בשתי טכניקות. ראשית, השתמשנו בטכניקת אימונופלואורסנציה כדי להכתים את סיב?.......

Discussion

קרטיטיס נוירוטרופית נחשבת למחלה נדירה, המשפיעה על 5 מתוך 10,000 אנשים. עם זאת, אנשים הסובלים NK עקב פגיעה פיזית כגון כוויות כימיות, או תסמונות כגון סוכרת או טרשת נפוצה אינם נכללים בסטטיסטיקה זו3. יתר על כן, מצב זה עדיין מאובחן באופן משמעותי22, ושכיחות המחלה מוערכת בחסר. י.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לד"ר קארין לולייה על הגישה לקו העכבר המהונדס MAGIC-Markers. המחברים מודים גם למתקן הליבה של בעלי החיים RAM-Neuro ולמתקן ההדמיה MRI, חבר בתשתית הלאומית צרפת-BioImaging הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04, "השקעות לעתיד"). מחקר זה נתמך על ידי תוכנית ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, אוניברסיטת מונפלייה, סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140), וקרן Groupama.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm seringe filterCLEARLINE51733
0.5 mm rust ring removerAlger Equipment CompanyBU-5S
2 mL plastic tubesEppendrof 30120094
Algerbrush burr, Complete instrumentAlger Equipment CompanyBR2-5
Anti-beta III Tubulin antibodyAbcamab18207
AntigenfixDiapathP0016
Artificial tearLarmes artificielles MartinetN/A
BuprecareAnimalcareN/A
Cotton swabAny providerN/A
Dissecting toolsFine Science ToolsN/A
FluoresceinMerck103887
Gelatin from cold water fish skinSigmaG7765
Goat serumMerckS26
Head HolderNarishigeSGM 4
Heated plateBIOSEB LAB instrumentsBIO-HE002
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Imalgene 1000BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH FranceN/AFrench marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X softwareLeicaN/ALarge volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra IICoherentN/A
Laser power meterCoherentN/A
Leica Thunder Imager Tissue microscopeLeicaN/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscopeZeissN/A
Ocry-gelTVM labN/A
Parametric oscillatorCoherentN/A
Penlights with blue cobalt filtercapBernellALPEN
Petri dishThermo Scientific150318Axotomy protocol
PetridishThermo Scientific150288Cornea whole-mount processing
Rompun 2%ElancoN/AFrench marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mmLCH medicalLCH-PUK-25
Triton X-100VWR0694
VectashieldEuroBioSciencesH-1000Mounting medium

References

  1. Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).
  2. Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved