שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

Summary

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

Abstract

הקרנית היא רקמה שקופה המכסה את העין והיא חיונית לראייה ברורה. זוהי הרקמה העצבנית ביותר בגוף. עצבוב זה מספק תחושה ותפקוד טרופי לעין ותורם לשמירה על שלמות הקרנית. השיבוש הפתולוגי של עצבוב זה נקרא קרטיטיס נוירוטרופית. זה יכול להיות מופעלות על ידי פגיעה בעין, ניתוח, או מחלה. במחקר זה, אנו מציעים שלושה פרוטוקולים שונים לגרימת נזק לעצבוב בדרכים המשחזרות את שלושת סוגי המקרים בהם נתקלים בדרך כלל במרפאה.

השיטה הראשונה מורכבת בביצוע שחיקה של אפיתל עם בור אופתלמי. מדובר בהסרת שכבת האפיתל, קצות העצבים החופשיים והמקלעת התת-בזאלית באופן דומה לניתוח כריתת קרניים פוטו-רפרקטיבי המבוצע במרפאה. השיטה השנייה מכוונת לעצבוב רק על ידי חתיכתו בפריפריה עם ניקוב ביופסיה, תוך שמירה על שלמות האפיתל. שיטה זו דומה לשלבים הראשונים של קרטופלסטיקה למלרית ומובילה לניוון של העצבוב ואחריו צמיחה מחודשת של האקסונים בקרנית המרכזית. השיטה האחרונה פוגעת בעצבוב של מודל עכבר מהונדס באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון, אשר ממקם באופן ספציפי את אתר הצריבה של סיבי העצב הפלואורסצנטיים. שיטה זו גורמת לאותו נזק כמו פוטוקרטיטיס, חשיפת יתר לאור UV.

מחקר זה מתאר אפשרויות שונות לחקר הפיזיופתולוגיה של עצבוב הקרנית, במיוחד הניוון וההתחדשות של האקסונים. קידום התחדשות הוא חיוני למניעת סיבוכים כגון פגמים אפיתל או אפילו ניקוב של הקרנית. המודלים המוצעים יכולים לסייע בבדיקת מולקולות פרמקולוגיות חדשות או ריפוי גנטי המשפרים את התחדשות העצבים ומגבילים את התקדמות המחלה.

Introduction

הקרנית, שהיא פני השטח השקופים של העין, מורכבת משלוש שכבות נפרדות: האפיתל, הסטרומה והאנדותל. לאיבר זה יש את צפיפות העצבוב הגבוהה ביותר בגוף והוא מורכב בעיקר מסיבי חישה (סוגים Aδ ו- C) שמקורם בענף העיניים של הגנגליון הטריגמינלי. סיבי החישה חודרים לשולי הקרנית באמצע הסטרומה בצורה של צרורות גדולים המסתעפים החוצה כדי לכסות את פני השטח. לאחר מכן הם מתפצלים כדי לחדור את קרום באומן וליצור את המקלעת התת-בסיסית, אשר ניתנת לזיהוי בקלות על ידי היווצרות מערבולת במרכז הקרנית. סיבים אלה מסתיימים כקצות עצבים חופשיים על פני השטח החיצוניים של האפיתל. הם מסוגלים להמיר גירויים תרמיים, מכניים וכימיים ולשחרר גורמים טרופיים החיוניים להומאוסטזיס^{אפיתל 1,2}

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים.

1. הכנות

1. הכינו תמיסת הרדמה של קטמין-קסילזין להרדמה. הזריקו קטמין ב-80 מ"ג/ק"ג וקסילזין ב-10 מ"ג/ק"ג על ידי דילול 200 מיקרוליטר קטמין (100 מ"ג/מ"ל) ו-125 מיקרוליטר קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) ב-2,175 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
2. הכינו תמיסת בופרנורפין 0.02 מ"ג/מ"ל כתמיסה משככת כאבים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין ל-1,400 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.
3. הכינו את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.
   1. השתמש במשקל עדין כדי לשקול 10 מ"ג של מלח פלואורסצאין ולדלל אותו ב -10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לקבל תמיסת פלואורסצאין 0.1%....

תוצאות

מחקר זה מציע מספר פרוטוקולים לגרימת נזק לעצבוב הקרנית בעכברים. בעוד פרוטוקולים דומים שימשו לחקר הפיזיופתולוגיה של ריפוי האפיתל, בחרנו להתאים ולפתח שיטות חדשות לחקר התחדשות עצבוב הקרנית. כדי להתבונן בעצבוב, השתמשנו בשתי טכניקות. ראשית, השתמשנו בטכניקת אימונופלואורסנציה כדי להכתים את סיב?.......

Discussion

קרטיטיס נוירוטרופית נחשבת למחלה נדירה, המשפיעה על 5 מתוך 10,000 אנשים. עם זאת, אנשים הסובלים NK עקב פגיעה פיזית כגון כוויות כימיות, או תסמונות כגון סוכרת או טרשת נפוצה אינם נכללים בסטטיסטיקה זו³. יתר על כן, מצב זה עדיין מאובחן באופן משמעותי²², ושכיחות המחלה מוערכת בחסר. י.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium