쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

요약

여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

초록

각막은 눈을 덮고 있는 투명한 조직으로 선명한 시력에 매우 중요합니다. 그것은 신체에서 가장 신경 분포가 심한 조직입니다. 이 신경 분포는 눈에 감각과 영양 기능을 제공하고 각막을 온전하게 보존하는 데 기여합니다. 이러한 신경 분포의 병리학적 파괴를 신경 영양성 각막염이라고 합니다. 이것은 눈 부상, 수술 또는 질병에 의해 유발될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 클리닉에서 일반적으로 접하는 세 가지 유형의 사례를 요약하는 방식으로 신경 자극에 손상을 입히기 위한 세 가지 프로토콜을 제안합니다.

첫 번째 방법은 안과 버로 상피를 마모시키는 것입니다. 여기에는 상피층, 자유 신경 말단 및 기저하 신경총을 제거하는 것이 포함되며 클리닉에서 수행되는 광굴절 각막 절제술 수술과 유사한 방식으로 수행됩니다. 두 번째 방법은 상피의 무결성을 유지하면서 생검 펀치로 주변부를 절개하여 신경 분포만을 표적으로 합니다. 이 방법은 라멜라 각막 성형술의 첫 번째 단계와 유사하며 신경 분포의 퇴화와 중앙 각막의 축삭의 재성장으로 이어집니다. 마지막 방법은 형광 신경 섬유의 소작 부위를 특이적으로 국소화하는 다광자 현미경을 사용하여 형질전환 마우스 모델의 신경 분포를 손상시킵니다. 이 방법은 자외선에 과도하게 노출되는 광각막염과 동일한 손상을 입힙니다.

이 연구는 각막 신경 분포의 생리병리학, 특히 축삭의 퇴화 및 재생을 조사하기 위한 다양한 옵션을 설명합니다. 재생을 촉진하는 것은 상피 결손이나 각막 천공과 같은 합병증을 피하는 데 매우 중요합니다. 제안된 모델은 신경 재생을 강화하고 질병 진행을 제한하는 새로운 약리학적 분자 또는 유전자 요법을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

눈의 투명한 표면인 각막은 상피, 기질, 내피의 세 가지 층으로 구성되어 있습니다. 이 기관은 신체에서 가장 높은 밀도의 신경 분포를 가지며 주로 삼차 신경절의 안과 분지에서 유래한 감각 섬유(Aδ 및 C 유형)로 구성됩니다. 감각 섬유는 간질 중간의 각막 주변부를 뚫고 표면을 덮기 위해 가지를 뻗는 큰 다발 형태로 침투합니다. 그런 다음 두 갈래로 갈라져 보우만 막을 뚫고 각막 중앙에 소용돌이가 형성되어 쉽게 알아볼 수 있는 기저하신경총을 형성합니다. 이러한 섬유는 상피의 외부 표면에서 자유 신경 말단으로 끝납니다. 그들은 열적, 기계적, 화학적 자극을 전달하고 상피 항상성에 필수적인 영양 인자를 방출할 수 있습니다 ^1,2. 신경영양성 각막염(NK)은 각막 감각 신경 분포에 영향을 미치는 퇴행성 질환입니다. 이 희귀 질환은 각막 민감도가 감소하거나 상실되어 눈물 생성이 감소하고 각막의 치유 특성이 저하되기 때문에 발생한다³. NK는 상피 결손이 생기는 1기부터 기질 융해 및/또는 각막 천공이 발생하는 3기까지 3단계로 진행된다⁴.

임상적으로 이 질병의 ....

프로토콜

모든 실험은 국립 동물 실험 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 준비

1. 마취를 위해 케타민-자일라진 마취액을 준비합니다. 멸균 0.9% NaCl 2,175mL에 케타민(100mg/mL) 200μL와 자일라진 125μL(20mg/mL)를 희석하여 케타민 80mg/kg, 자일라진 10mg/kg을 주입합니다.
2. 멸균 0.9% NaCl 1,400mL에 0.3mg/mL 부프레노르핀 100μL를 첨가하여 진통제로 0.02mg/mL 부프레노르핀 용액을 준비합니다.
3. 형광 염색 용액을 준비합니다.
   1. 미세한 저울을 사용하여 10mg의 플루오레세인 염을 칭량하고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석하여 0.1% 플루오레세인 용액을 얻습니다.
   2. 용액을 빛으로부터 보호하고 5분 동안 흔듭니다. 10mL 주사기와 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
      알림: 형광 용액은 빛으로부터 보호되어야 하며 +4°C에서 5일 동안 보관할 수 있습니다.
4. 마우스 준비
   1. 마우스의 무게를 잰 후 마취액의 마우스 무게(MW) 10μL/g을 복강내 주사하여 마취를 유도합니다. 마우스가 움직....

토론

신경영양성 각막염은 10,000명 중 5명에게 영향을 미치는 희귀 질환으로 간주됩니다. 그러나 화학적 화상과 같은 신체적 손상이나 당뇨병, 다발성 경화증과 같은 증후군으로 인해 NK를 앓고 있는 사람은 이러한 통계에 포함되지 않는다³. 더욱이, 이 질환은 여전히 현저하게 과소 진단되고^있으며22 이 질병의 유병률은 과소평가되고 있다. 환자의 시력을 보존하는 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium