مجموعة متزامنة من دماغ ومصل الفئران الجنيني لتقييم آثار النظام الغذائي للأم على التغذية والنمو العصبي في الورم العصبي الليفي من النوع 1

Summary

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة للجمع المتزامن لأنسجة دماغ الجنين بالإضافة إلى مصل عالي الجودة غير متحلل من نفس جنين الفأر. لقد استخدمنا هذه التقنية لاستجواب كيفية تأثير التعرض الغذائي للأم على ملامح المغذيات الكبيرة والتطور العصبي للجنين في الفئران متغايرة الزيجوت ل Nf1 (الورم العصبي الليفي من النوع 1).

Abstract

ثبت أن السمنة الناجمة عن النظام الغذائي للأمهات تغير النمو العصبي لدى النسل ، مما قد يؤدي إلى انخفاض القدرة المعرفية وفرط النشاط وضعف السلوك الاجتماعي. قد يعاني المرضى الذين يعانون من الاضطراب الوراثي غير المتجانس سريريا الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) من عجز مماثل ، ولكن من غير الواضح حاليا ما إذا كانت العوامل البيئية مثل النظام الغذائي للأم تؤثر على تطور هذه الأنماط الظاهرية ، وإذا كان الأمر كذلك ، فما هي الآلية التي سيحدث بها هذا التأثير. لتمكين تقييم كيفية تأثير التعرض للنظام الغذائي السمني للأمهات على العوامل الجهازية ذات الصلة بالنمو العصبي في NF1 ، قمنا بتطوير طريقة لجمع المصل غير المتحلل والأدمغة الكاملة أو الإقليمية التشريح الدقيق في وقت واحد من نسل الجنين من سدود الفئران التي تتغذى على نظام غذائي مراقب مقابل نظام غذائي غني بالدهون وعالي السكروز. تمت معالجة الأدمغة للاستئصال بالتبريد أو التجميد السريع لاستخدامها في الحمض النووي الريبي اللاحق أو عزل البروتين. تم التحقق من جودة الأنسجة التي تم جمعها عن طريق التلوين المناعي. تم التحقق من جودة المصل من خلال تحليل ملامح المغذيات الكبيرة. باستخدام هذه التقنية ، حددنا أن النظام الغذائي السمين للأمهات يزيد من كوليسترول الدم في مصل الجنين بالمثل بين WT و Nf1-متغاير الزيجوت.

Introduction

يعتبر الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) من RASopathy ، وهي مجموعة من الاضطرابات التي تتميز بطفرات جينية في السلالة الجرثومية تؤدي إلى تنشيط مسار إشارات RAS / MAPK (فيروس ساركوما RAt / بروتين كيناز المنشط بالميتوجين). المرضى الذين يعانون من NF1 RASopathy معرضون لخطر الإصابة بالعديد من المظاهر المختلفة ، بما في ذلك الأورام الحميدة والخبيثة في الوسط (الورم الدبقي في المسار البصري^1،2 ، الورم الدبقي عالي^{الدرجة 3،4}) والمحيطي (الورم الليفي العصبي^{الضفيري 5،6} ، ورم غمد الأعصاب المحيطي^{الخبيث 7،8}) الجهاز العصبي وكذلك خلل التنسج العظمي⁹ والتشوهات الصباغية^{الجلدية 10} (النمش الإبطي ، اللطخات المقهى). يتم التعرف على تأثير هذا الاضطراب على الإدراك والنمو العصبي بشكل متزايد ، حيث أظهر مرضى NF1 زيادة في حدوث عجز التعلم وفرط النشاط واضطراب طيف^{التوحد 11،12،13}. ومع ذلك ، هناك عدم تجانس كبير في تطور هذه الأنماط الظاهرية بين المرضى^{13،14،15،16،17} ، ومن غير الواضح سبب ظهور بعض المرضى على ضعف إدراكي كبير بينما لا يتأثر الآخرون. ثبت أن السمنة الناجمة عن النظام الغذائي للأمهات تؤثر بالمثل على التعلم والسلوك لدى عامة السكان^{18،19،20،21،22}،^{23،24،25،26،27،28}، مما يشير إلى أن التعرض الغذائي التفاضلي للأمهات في NF1 يمكن أن يكون أحد مصادر هذا التغايرية السريرية. على وجه الخصوص ، يظهر أطفال الأمهات البدينات خطرا متزايدا للإصابة بفرط النشاط^{18،19،20،23،25،26} ، والتوحد^19،24،27 ، وعجز الوظائف التنفيذية^21،23 ، ولديهم درجات ذكاء أقل^{على نطاق واسع 22،28}. ومع ذلك ، فإن المرضى الذين يعانون من NF1 قد غيروا الأنماط الظاهرية الأيضية مقارنة بعامة السكان ، بما في ذلك انخفاض الإصابة بالسمنة ومرض السكري^29،30،31 ، مما يجعل من غير الواضح ما إذا كانوا سيستجيبون بشكل مشابه للمنبهات الغذائية.

لمعالجة هذه الأسئلة ، أردنا تحديد ما إذا كانت التغييرات التي يسببها النظام الغذائي السمين في ملف تعريف المغذيات الكبيرة في نسل الجنين مع Nf1 ساهمت في تغيرات النمو العصبي. لقد جمعنا سابقا أنسجة تشريح دقيقة كاملة وإقليمية عالية الجودة مناسبة لتطبيقات النمو العصبي من دماغ^{الجنين 32}. ومع ذلك ، فإن جمع دم الجنين يمثل تحديا بسبب صغر حجم الجسم وانخفاض حجم الدم³³. أدى جمع الدم عن طريق التصريف بمساعدة الجاذبية بعد قطع الرأس إلى انخفاض أحجام التجميع وانحلال الدم الكبير في عيناتنا ، مما قد يؤثر على تفسير التطبيق النهائي. كان الجمع عن طريق الشفط من قلب الجنين أو الأوعية الصدرية ، كما تم الإبلاغ عنه^{سابقا 33} ، أمرا صعبا من الناحية الفنية وأدى أيضا إلى انحلال الدم المتكرر. وهكذا طورنا طريقة لجمع مصل الجنين ، والتي تستخدم أنابيب شعرية متخصصة للسماح بجمع كميات أكبر دون إجهاد قص كبير.

هنا ، نقدم هذه الطريقة لجمع الأدمغة الجنينية ومصل الجنين في وقت واحد من الجراء غير المتجانسة Nf1 المعرضة لنظام غذائي غني بالدهون وعالي السكر مقابل نظام غذائي للتحكم في الرحم (الشكل 1 والجدول التكميلي S1). تم تضمين الأدمغة بالتبريد للتحليل اللاحق عن طريق التألق المناعي أو تشريح مجهري إقليمي وتجميدها سريعا للاستخدام اللاحق في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية. تم الحصول على مصل عالي الجودة ، مناسب للتطبيقات النهائية مثل توصيف المغذيات الكبيرة. باستخدام هذه الطريقة ، حددنا أن التعرض الغذائي للأمهات عالي الدهون وعالي السكروز يؤدي إلى ارتفاع مستويات الكوليسترول في الدم في كل من الجراء WT و Nf1-متغايرة الزيجوت.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة إرشادات المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة واشنطن في سانت لويس. تم إيواء مع ضوء قياسي لمدة 12 ساعة: ركوب الدراجات الداكن والوصول المجاني إلى الطعام والماء.

1. حمية الأم

1. ضع إناث الفئران على طعام التحكم (CD) أو النظام الغذائي المسببة للسمنة (Ob) في عمر 4 أسابيع.
2. في عمر 8-12 أسبوعا ، قم بإعداد التزاوج الموقوت عن طريق مراقبة السدادة المخاطية للسد في الصباح الباكر لتحديد عمر التجميع الصحيح. للتحقق من السمنة الناجمة عن النظام الغذائي ، قم بوزن الإناث عند التزاوج.
   ملاحظة: تم استخدام نطاق من 8-12 أسبوعا لإعداد التزاوج الأولي للتأكد من أن الإناث اللواتي يتغذين على النظام الغذائي المسببة للسمنة يعانين من زيادة الوزن مقارنة بنظيراتهن ، وهو ما لم يحدث دائما بحلول عمر 8 أسابيع. يعتبر يوم القابس هو اليوم الجنيني 1 (E1) ، وتم جمع جميع المستخدمة في هذه الدراسة في E19. تم اختيار النقطة الزمنية المتأخرة للجنين بسبب التغيرات النمائية العصبية التي لوحظت سابقا في هذا الوقت في المعرضة للنظام الغذائي المسببة للسمنة (البيانات غير معروضة).

2. إزالة الجنين من السد

1. أولا ، تأكد من أن السد يبدو حاملا (شكل البطن وامتلاءه ، أو ملامسة البطن ، أو حركة الجنين). إذا كنت في شك ، فقم بوزن الأنثى مرة أخرى لقياس زيادة الوزن.
   ملاحظة: يجب أن تظهر الفئران الحامل المتأخرة ما لا يقل عن 3-4 جم من زيادة الوزن. لزيادة احتمالية الحمل في الإطار الزمني المطلوب ، يمكن إضافة نشارة الخشب المتسخة (المحتوية على البول والفرمون) من قفص الذكور إلى قفص الأنثى يوميا لمدة 3 أيام قبل التزاوج للحث على الشبق³⁴.
2. قم بالقتل الرحيم للسد عن طريق وضعه في غرفة بمنشفة ورقية تحتوي على 3 مل من الأيزوفلوران ، مع الحرص على تجنب الاتصال المباشر بين السد والمنشفة الورقية المبللة بالتخدير. بعد تخدير ، ضعه على منشفة ورقية ، وامسكه من الذيل ، ثم ضع مقص التشريح على الرقبة ، ثم أجبر المقص لأعلى باتجاه الرأس لأداء خلع عنق الرحم. بدلا من ذلك ، قم بقطع الرأس بعد تخدير الأيزوفلوران.
   ملاحظة: يمكن جمع المصل من السد في هذه الخطوة ، باستخدام منهجية مماثلة كما هو موضح أدناه ولكن باستخدام أنابيب شعرية أكبر. إذا كان ذلك مطلوبا ، فيجب إجراء قطع الرأس بدلا من خلع عنق الرحم. يجب توخي الحذر لضمان عدم تغيير النمط الظاهري المعني بإعطاء الأيزوفلوران مباشرة قبل القتل الرحيم.
3. ضع الجانب البطني للسد لأعلى في طبق 100 مم. اضغط على الجلد الذي يغطي البطن وقم بعمل شق خط الوسط بمقص التشريح. قم بعمل شقوق إضافية بشكل عمودي على شق خط الوسط لإنشاء سدائل جلدية لكشف الرحم الذي يحتوي على الأجنة.
4. اسحب الرحم من تجويف البطن. باستخدام المقص ، افصل الرحم عن السد. ضع الكيس الجنيني السليم ("اللؤلؤ على خيط") الذي يحتوي على الأجنة في طبق به محلول ملحي معقم بارد 1x مخزن بالفوسفات (PBS). ضع طبق الأجنة على الثلج.
   ملاحظة: نظرا لأن كل فضلات تحتوي عادة على 6-10 صغار سيتم حصادها لكل من الأدمغة والمصل ، يتم الاحتفاظ بالأجنة على الجليد لتجنب تدهور الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يضمن وضع الجراء على الجليد القتل الرحيم الكافي للجراء ، حيث قد لا يكون القتل الرحيم للأمهات وحده كافيا دائما. إذا كنت ترغب في جمع المصل فقط ، فقد يفضل جمع درجة حرارة الغرفة.

3. جمع مصل الجنين

1. قم بإزالة الجنين من الكيس الجنيني عن طريق تشريح بعناية باستخدام ملقط # 5. انقل الجنين إلى طبق باستخدام ملقط منحني مع معقم بارد طازج 1x PBS.
2. امسح برفق على منشفة ورقية لإزالة السائل الأمنيوسي المتبقي و PBS من العينة.
3. امسك من البطن. قطع رأس جزئيا بمقص دقيق عن طريق عمل شق في الرقبة البطنية. تأكد من قطع الأوعية الدموية ، لكن الجلد الذي يحافظ على الرأس لا يزال متصلا.
   ملاحظة: يجب أن يظل الرأس متصلا حتى يمكن جمع الدم من الجسم والرأس في وقت واحد.
4. امسك الجسم بزاوية 45 درجة بحيث يكون الشق متجها لأسفل. أمسك الأنبوب الشعري (الأنبوب الشعري) سعة 50 ميكرولتر بالتوازي مع موقع شق السد حيث يشكل الدم قطرة. اترك بعناية الأنبوب الشعري سعة 50 ميكرولتر يمتلئ بالدم.
   ملاحظة: يمكن استخدام الأنبوب الشعري x2 أو 100 ميكرولتر أنبوب شعري لجمع ما يصل إلى ~ 75 ميكرولتر من الدم.
5. ضع الرأس في طبق طازج مقاس 60 مم يحتوي على 1x PBS بارد ومعقم لمزيد من جمع الأنسجة (القسم 4).
6. بعد أن يكون الدم داخل الأنبوب الشعري ، اضغط على المكبس بسرعة في أنبوب سعة 1.5 مل. قم بنقر الأنبوب أو تدويره بسرعة للتأكد من وجود الدم في قاع الأنبوب.
7. كرر لبقية القمامة.
   ملاحظة: يعد إبقاء الجراء على الجليد والتنقل بسرعة بينهما أمرا ضروريا لتقليل مخاطر التخثر بعد الوفاة الذي سيحد من حجم الجمع.
8. تخثر الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
9. الطرد المركزي لعينات الدم عند 4 درجات مئوية ، 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة.
10. انقل المصل إلى أنابيب جديدة سعة 500 ميكرولتر باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، دون إزعاج حبيبات خلايا الدم في الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: يجب أن يكون المصل بلون القش بدون حطام أحمر. يجب أن ينتج كل جنين 15-30 ميكرولتر من المصل.
11. قم بتخزين السيروم الذي تم جمعه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. جمع دماغ الجنين

1. بالنظر من خلال مجهر التشريح ، أمسك الخطم باستخدام ملقط منحني واستخدم ملقط # 5 لتقشير الجلد بعناية من غطاء الجمجمة ، مع إبقائه متصلا بالأنف لسهولة الإمساك به. زاوية # 5 ملقط إلى 45 درجة بالنسبة للجمجمة ، ثقب الغشاء الشفاف الذي هو الجمجمة النامية بعناية ، وقم بتحويل الملقط بالتوازي مع الجمجمة ، وأدخله أسفل غطاء الجمجمة ، ثم قرصة وقشر إلى جانب واحد. بعد إزالة جانب واحد ، أمسك الجانب المتبقي بالملقط # 5 وقشره إلى الجانب الآخر.
2. أخرج الدماغ برفق من الجمجمة باستخدام ملعقة صغيرة وانقل الدماغ إلى طبق طازج مقاس 60 مم يحتوي على 1x PBS بارد.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إصلاح الأدمغة بأكملها وتضمينها في التلوين المناعي. انظر المنهجية المنشورة^{سابقا 32}.
3. إذا كان لا بد من تجميد الأنسجة للتطبيقات الجزيئية الأخرى ، فقم بتشريح منطقة الاهتمام الفرعية. يتم وصف عزل الأنسجة المحيطة بالبطينين حول البطينين الجانبي والثالث والرابع.
   1. باستخدام الملقط المنحني ، أمسك الدماغ عند تقاطع الدماغ الخلفي والدماغ الأمامي باليد غير المهيمنة. باليد المهيمنة ، أمسك المشرط بالشفرة الموازية لسطح الدماغ. اضغط بقوة على المنطقة الوسطى القشرية (الشكل 1).
   2. لا تزال تمسك الدماغ الخلفي ، قم بعمل شق ثان أمام الدماغ الخلفي لفصله عن الدماغ الأمامي (الشكل 1). في القسم الأمامي ، ابحث عن مساحتين نصف دائريتين صغيرتين تقعان داخل المستوى الأفقي ، وهما البطينان الجانبيان. استخدم الملقط المنحني الموضوع في وسط كل بطين لتثبيت الدماغ في مكانه ، وقم بتشريح البطانة بعناية باستخدام ملقط # 5 ، ثم قم بإزالته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف 1.5 مل.
   3. في القسم الأوسط ، ابحث عن مساحة خطية صغيرة على السطح البطني ، وهو البطين الثالث. باستخدام ملقط # 5 ، قم بقرص البطانة بعناية على جانبي سطح البطين ، ثم قم بإزالته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف 1.5 مل.
   4. في القسم الخلفي ، ابحث عن مساحة خطية صغيرة مركزية داخل الدماغ الخلفي ، وهو البطين الرابع. قم بتشريح البطانة على كلا الجانبين باستخدام ملقط # 5 ، ثم قم بإزالتها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف 1.5 مل.
      ملاحظة: إذا لم يكن تقطيع الدماغ الخلفي قطعا نظيفا ، فقد يتم حجب أنسجة البطين الرابع و / أو تدميرها.
   5. بالنسبة للخطوات 4.3.2-4.3.4 ، مباشرة بعد وضع الأنسجة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، ضع الأنابيب بسرعة في حاوية آمنة للتبريد تحتوي على النيتروجين السائل.
      ملاحظة: يمكن حفظ الأنابيب في النيتروجين السائل حتى يتم تشريح العينات المتبقية. تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل قضمة الصقيع الشديدة. لا تضع يديك مباشرة في النيتروجين السائل وتجنب البقع.
   6. ضع الأنبوب (الأنابيب) المجمدة على الثلج الجاف وانقل المناديل المجمدة إلى فريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

النتائج

لتوضيح جودة أنسجة المخ التي تم الحصول عليها من خلال هذه التقنية ، نعرض عينة من أدمغة الجنين من فئران Nestin-CFPnuc³⁵ ، ملطخة بالمناعة ل GFAP وفقا لتقنية تم الإبلاغ عنها^{سابقا 32}. تظهر خلايا Nestin ⁺ تبطن البطين الجانبي (الشكل 2 أ) ، مع خيوط ...

Discussion

تشمل الطرق التقليدية لجمع الدم من الفئران خلف البصيلة ، ووريد الذيل ، والوريد الصافن ، والوريد الوجهي ، ونزيف الوريد الوداجي^40،41،42. لسوء الحظ ، هذه الطرق ليست مثالية لجمع الدم الجنيني بسبب حجم والأوعية الدموية الصغيرة و...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.