مجموعة متزامنة من دماغ ومصل الفئران الجنيني لتقييم آثار النظام الغذائي للأم على التغذية والنمو العصبي في الورم العصبي الليفي من النوع 1

Summary

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة للجمع المتزامن لأنسجة دماغ الجنين بالإضافة إلى مصل عالي الجودة غير متحلل من نفس جنين الفأر. لقد استخدمنا هذه التقنية لاستجواب كيفية تأثير التعرض الغذائي للأم على ملامح المغذيات الكبيرة والتطور العصبي للجنين في الفئران متغايرة الزيجوت ل Nf1 (الورم العصبي الليفي من النوع 1).

Abstract

ثبت أن السمنة الناجمة عن النظام الغذائي للأمهات تغير النمو العصبي لدى النسل ، مما قد يؤدي إلى انخفاض القدرة المعرفية وفرط النشاط وضعف السلوك الاجتماعي. قد يعاني المرضى الذين يعانون من الاضطراب الوراثي غير المتجانس سريريا الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) من عجز مماثل ، ولكن من غير الواضح حاليا ما إذا كانت العوامل البيئية مثل النظام الغذائي للأم تؤثر على تطور هذه الأنماط الظاهرية ، وإذا كان الأمر كذلك ، فما هي الآلية التي سيحدث بها هذا التأثير. لتمكين تقييم كيفية تأثير التعرض للنظام الغذائي السمني للأمهات على العوامل الجهازية ذات الصلة بالنمو العصبي في NF1 ، قمنا بتطوير طريقة لجمع المصل غير المتحلل والأدمغة الكاملة أو الإقليمية التشريح الدقيق في وقت واحد من نسل الجنين من سدود الفئران التي تتغذى على نظام غذائي مراقب مقابل نظام غذائي غني بالدهون وعالي السكروز. تمت معالجة الأدمغة للاستئصال بالتبريد أو التجميد السريع لاستخدامها في الحمض النووي الريبي اللاحق أو عزل البروتين. تم التحقق من جودة الأنسجة التي تم جمعها عن طريق التلوين المناعي. تم التحقق من جودة المصل من خلال تحليل ملامح المغذيات الكبيرة. باستخدام هذه التقنية ، حددنا أن النظام الغذائي السمين للأمهات يزيد من كوليسترول الدم في مصل الجنين بالمثل بين WT و Nf1-متغاير الزيجوت.

Introduction

يعتبر الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) من RASopathy ، وهي مجموعة من الاضطرابات التي تتميز بطفرات جينية في السلالة الجرثومية تؤدي إلى تنشيط مسار إشارات RAS / MAPK (فيروس ساركوما RAt / بروتين كيناز المنشط بالميتوجين). المرضى الذين يعانون من NF1 RASopathy معرضون لخطر الإصابة بالعديد من المظاهر المختلفة ، بما في ذلك الأورام الحميدة والخبيثة في الوسط (الورم الدبقي في المسار البصري^1،2 ، الورم الدبقي عالي^{الدرجة 3،4}) والمحيطي (الورم الليفي العصبي^{الضفيري 5،6} ، ورم غ....

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة إرشادات المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة واشنطن في سانت لويس. تم إيواء مع ضوء قياسي لمدة 12 ساعة: ركوب الدراجات الداكن والوصول المجاني إلى الطعام والماء.

1. حمية الأم

1. ضع إناث الفئران على طعام التحكم (CD) أو النظام الغذائي المسببة للسمنة (Ob) في عمر 4 أسابيع.
2. في عمر 8-12 أسبوعا ، قم بإعداد التزاوج الموقوت عن طريق مراقبة السدادة المخاطية للسد في الصباح الباكر لتحديد عمر التجميع الصحيح. للتحقق من السمنة الناجمة عن النظام الغذائي ، قم بوزن الإناث عند التزاوج.
   ملاحظة: تم ا....

النتائج

لتوضيح جودة أنسجة المخ التي تم الحصول عليها من خلال هذه التقنية ، نعرض عينة من أدمغة الجنين من فئران Nestin-CFPnuc³⁵ ، ملطخة بالمناعة ل GFAP وفقا لتقنية تم الإبلاغ عنها^{سابقا 32}. تظهر خلايا Nestin ⁺ تبطن البطين الجانبي (الشكل 2 أ) ، مع خيوط .......

Discussion

تشمل الطرق التقليدية لجمع الدم من الفئران خلف البصيلة ، ووريد الذيل ، والوريد الصافن ، والوريد الوجهي ، ونزيف الوريد الوداجي^40،41،42. لسوء الحظ ، هذه الطرق ليست مثالية لجمع الدم الجنيني بسبب حجم والأوعية الدموية الصغيرة و.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.