Одновременный сбор данных о мозге и сыворотке крови плода мыши для оценки влияния диеты матери на питание и развитие нервной системы при нейрофиброматозе 1 типа

Резюме

В этом протоколе мы описываем метод одновременного сбора мозговой ткани плода, а также высококачественной негемолизированной сыворотки из одного и того же эмбриона мыши. Мы использовали этот метод для изучения того, как воздействие пищи на организм матери влияет на профили макронутриентов и развитие нервной системы плода у мышей, гетерозиготных по Nf1 (нейрофиброматоз 1 типа).

Аннотация

Было продемонстрировано, что ожирение, вызванное материнским питанием, изменяет развитие нервной системы у потомства, что может привести к снижению когнитивных способностей, гиперактивности и нарушениям в социальном поведении. Пациенты с клинически гетерогенным генетическим заболеванием нейрофиброматозом 1-го типа (НФ1) могут иметь аналогичные дефициты, но в настоящее время неясно, влияют ли факторы окружающей среды, такие как материнская диета, на развитие этих фенотипов, и если да, то с помощью какого механизма может произойти такой эффект. Чтобы дать возможность оценить, как воздействие диеты матери на ожирение влияет на системные факторы, связанные с развитием нервной системы при NF1, мы разработали метод одновременного сбора негемолизированной сыворотки и целого или регионально микрорасчлененного мозга от плода мышиных самок, получавших контрольную диету, в сравнении с диетой с высоким содержанием жиров и сахарозы. Мозг обрабатывали для криосекции или мгновенной заморозки для использования для последующего выделения РНК или белка; Качество собранной ткани было проверено с помощью иммуноокрашивания. Качество сыворотки было проверено путем анализа профилей макронутриентов. Используя эту методику, мы установили, что диета матери с ожирением повышает уровень холестерина в сыворотке крови плода аналогично между гетерозиготными детенышами WT и Nf1.

Введение

Нейрофиброматоз 1-го типа (NF1) считается RASopathy, группой расстройств, характеризующихся генетическими мутациями зародышевой линии, приводящими к активации сигнального пути RAS/MAPK (вирус саркомы RAt/митоген-активируемая протеинкиназа). Пациенты с NF1 RASopathy подвержены риску развития многих различных проявлений, включая как доброкачественные, так и злокачественные опухоли центральной (глиома зрительного пути ^1,2, глиома высокой степени^{злокачественности 3,4}) и периферической (плексиформная нейрофиброма

протокол

Все процедуры на животных в этом исследовании соответствовали рекомендациям NIH и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Вашингтонского университета в Сент-Луисе. Животные содержались со стандартным 12-часовым циклом «свет:темнота» и свободным доступом к еде и воде.

1. Материнский рацион

1. Посадите самок мышей на контрольную диету (CD) или диету для ожирения (Ob) в возрасте 4 недель.
2. В возрасте 8-12 недель организуйте спаривание по времени, наблюдая за слизистой пробкой матери ранним утром, чтобы определить правильный возраст сбора. Чтобы убедитьс....

Результаты

Чтобы проиллюстрировать качество мозговой ткани, полученной с помощью этого метода, мы показали образцы эмбрионального мозга мышей Nestin-CFPnuc³⁵, иммуноокрашенных на GFAP в соответствии с ранее описанной методикой³². Клетки Nestin⁺ выстилают бок.......

Обсуждение

Традиционные методы сбора крови у мышей включают ретробульбарную, хвостовую вену, подкожную вену, лицевую вену и кровотечение из яремной вены 40,41,42. К сожалению, эти методы не идеальны для забора эмбриональной крови и?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.