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Resumen

En este protocolo, describimos un método para la recolección simultánea de tejido cerebral fetal, así como suero no hemolizado de alta calidad del mismo embrión de ratón. Hemos utilizado esta técnica para interrogar cómo la exposición dietética materna afecta los perfiles de macronutrientes y el neurodesarrollo fetal en ratones heterocigotos para Nf1 (Neurofibromatosis Tipo 1).

Resumen

Se ha demostrado que la obesidad materna inducida por la dieta altera el desarrollo neurológico en la descendencia, lo que puede conducir a una reducción de la capacidad cognitiva, hiperactividad y deficiencias en el comportamiento social. Los pacientes con el trastorno genético clínicamente heterogéneo Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) pueden presentar déficits similares, pero actualmente no está claro si los factores ambientales, como la dieta materna, influyen en el desarrollo de estos fenotipos y, de ser así, el mecanismo por el cual se produciría tal efecto. Para permitir la evaluación de cómo la exposición materna a la dieta obesogénica afecta a los factores sistémicos relevantes para el neurodesarrollo en NF1, hemos desarrollado un método para recolectar simultáneamente suero no hemolizado y cerebros enteros o microdisecados regionalmente de descendientes fetales de madres murinas alimentadas con una dieta de control frente a una dieta alta en grasas y sacarosa. Los cerebros se procesaron para crioseccionar o congelar rápidamente para su uso en el posterior aislamiento de ARN o proteínas; La calidad del tejido recolectado se verificó mediante inmunotinción. La calidad del suero se verificó mediante el análisis de perfiles de macronutrientes. Utilizando esta técnica, hemos identificado que la dieta obesogénica materna aumenta el colesterol sérico fetal de manera similar entre las crías WT y Nf1-heterocigóticas.

Introducción

La neurofibromatosis tipo 1 (NF1) se considera una RASopatía, un grupo de trastornos caracterizados por mutaciones genéticas de la línea germinal que dan lugar a la activación de la vía de señalización RAS/MAPK (virus del sarcoma RAt/proteína quinasa activada por mitógenos). Los pacientes con RARA NF1 tienen riesgo de desarrollar muchas manifestaciones diferentes, incluyendo tumores benignos y malignos del sistema nervioso central (glioma de la vía óptica 1,2, glioma de alto grado 3,4) y periférico (neurofibroma plexiforme 5,6, tumor maligno de la vaina del nervio periférico 7,8), así como displasias óseas9 y anomalías pigmentarias de la piel10 (pecas axilares, máculas café con leche). El efecto de este trastorno sobre la cognición y el neurodesarrollo está siendo cada vez más reconocido, y los pacientes con NF1 muestran una mayor incidencia de déficits de aprendizaje, hiperactividad y trastorno del espectro autista 11,12,13. Sin embargo, existe una heterogeneidad significativa en el desarrollo de estos fenotipos entre los pacientes 13,14,15,16,17, y no está claro por qué algunos pacientes muestran deterioros cognitivos significativos mientras que otros no se ven afectados. Se ha demostrado que la obesidad materna inducida por la dieta afecta de manera similar el aprendizaje y el comportamiento en la población general 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, lo que sugiere que las exposiciones dietéticas maternas diferenciales en NF1 podrían ser una fuente de esta heterogeneidad clínica. En particular, los hijos de madres obesas muestran un mayor riesgo de desarrollar hiperactividad 18,19,20,23,25,26, autismo 19,24,27, déficits de la función ejecutiva21,23 y tienen puntuaciones de CI a escala completa más bajas22,28. Sin embargo, los pacientes con NF1 tienen fenotipos metabólicos alterados en comparación con la población general, incluyendo una menor incidencia de obesidad y diabetes 29,30,31, por lo que no está claro si responderían de manera similar a los estímulos dietéticos.

Para responder a estas preguntas, deseábamos determinar si los cambios inducidos por la dieta obesogénica en el perfil de macronutrientes en la descendencia fetal con Nf1 contribuían a los cambios en el desarrollo neurológico. Previamente hemos recolectado tejido entero de alta calidad y microdisecado regionalmente apropiado para aplicaciones de neurodesarrollo del cerebro fetal32. Sin embargo, la recolección de sangre fetal es un desafío debido al pequeño tamaño corporal y al bajo volumen sanguíneo33. La recolección de sangre a través del drenaje asistido por gravedad después de la decapitación condujo a volúmenes de recolección bajos y hemólisis significativa en nuestras muestras, lo que puede afectar la interpretación de la aplicación posterior. La recolección por aspiración del corazón fetal o de los vasos torácicos, como se ha reportado previamente33, fue técnicamente desafiante y también resultó en hemólisis frecuente. Por lo tanto, desarrollamos un método para la recolección de suero fetal, que utiliza tubos capilares especializados para permitir una recolección de mayor volumen sin un esfuerzo de cizallamiento significativo.

Aquí, presentamos este método para recolectar simultáneamente cerebros embrionarios y suero fetal de cachorros heterocigotos Nf1 expuestos a una dieta alta en grasas y azúcares en comparación con una dieta de control en el útero (Figura 1 y Tabla Suplementaria S1). Los cerebros se crioincrustaron para su posterior análisis por inmunofluorescencia o se microdiseccionaron regionalmente y se congelaron rápidamente para su uso posterior en aplicaciones de biología molecular. Se obtuvo un suero de alta calidad, adecuado para aplicaciones posteriores como el perfil de macronutrientes. Utilizando este método, identificamos que la exposición dietética materna alta en grasas y alta en sacarosa conduce a la elevación de los niveles de colesterol sérico tanto en cachorros heterocigotos WT como Nf1.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales en este estudio siguieron las pautas de los NIH y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington en St. Louis. Los animales se alojaron con un ciclo estándar de luz:oscuridad de 12 horas y acceso libre a comida y agua.

1. Dieta materna

  1. Coloque a los ratones hembra en comida de control (CD) o dieta obesogénica (Ob) a las 4 semanas de edad.
  2. A las 8-12 semanas de edad, establezca un apareamiento cronometrado monitoreando el tapón mucoso de la madre temprano en la mañana para determinar la edad de recolección correcta. Para verificar la obesidad inducida por la dieta, pesa a las hembras en el momento del apareamiento.
    NOTA: Se utilizó un rango de 8 a 12 semanas para la configuración inicial del apareamiento para garantizar que las hembras alimentadas con dieta obesogénica tuvieran sobrepeso en comparación con sus contrapartes, lo que no siempre ocurría a las 8 semanas de edad. El día del tapón se considera embrionario día 1 (E1), y todos los animales utilizados en este estudio se recolectaron en E19. Se eligió el punto de tiempo fetal tardío debido a los cambios en el desarrollo neurológico observados previamente en este momento en animales expuestos a la dieta obesogénica (datos no mostrados).

2. Extracción del feto de la madre

  1. En primer lugar, asegúrese de que la madre tenga un aspecto grávido (forma y plenitud abdominal, palpación abdominal o movimiento fetal). En caso de duda, vuelva a pesar a la hembra para medir el aumento de peso.
    NOTA: Las ratas embarazadas tardías deben mostrar al menos 3-4 g de aumento de peso. Para aumentar la probabilidad de concepción en el período de tiempo deseado, se puede agregar aserrín sucio (que contiene orina y feromonas) de la jaula de un macho a la jaula de la hembra diariamente durante 3 días antes del apareamiento para inducirel celo.
  2. Eutanasiar el dique colocándolo en una cámara con una toalla de papel que contenga 3 mL de isoflurano, teniendo cuidado de evitar el contacto directo entre el dique y la toalla de papel empapada en anestésico. Después de que el animal esté sedado, colóquelo sobre una toalla de papel, sujételo por la cola, coloque las tijeras de disección en el cuello y luego fuerce las tijeras hacia arriba hacia la cabeza para realizar la dislocación cervical. Alternativamente, realizar la decapitación después de la sedación con isoflurano.
    NOTA: El suero se puede recolectar de la presa en este paso, utilizando una metodología similar a la que se describe a continuación, pero con tubos capilares más grandes. Si esto se desea, se debe realizar la decapitación en lugar de la luxación cervical. Se debe tener cuidado de asegurar que el fenotipo de interés no se vea alterado por la administración de isoflurano inmediatamente antes de la eutanasia.
  3. Coloque la presa con el lado ventral hacia arriba en un plato de 100 mm. Pellizque la piel que cubre el abdomen y haga una incisión en la línea media con unas tijeras de disección. Hacer incisiones adicionales perpendiculares a la incisión de la línea media para crear colgajos de piel que expongan el útero que contiene los embriones.
  4. Saca el útero de la cavidad abdominal. Con unas tijeras, desconecte el útero del dique. Coloque el saco embrionario intacto ("perlas en un hilo") que contiene los embriones en un plato con solución salina fría y estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x. Coloca el plato de fetos con hielo.
    NOTA: Como cada camada suele contener de 6 a 10 crías que se cosecharán tanto para el cerebro como para el suero, los fetos se mantienen en hielo para evitar la degradación del tejido. Además, colocar a los cachorros en hielo garantiza una eutanasia adecuada de los cachorros, ya que la eutanasia materna por sí sola no siempre es suficiente. Si solo se desea la recolección de suero, se puede preferir la recolección a temperatura ambiente.

3. Colección de suero fetal

  1. Retire el feto del saco embrionario diseccionándolo cuidadosamente con pinzas #5. Transfiera el embrión a una placa usando pinzas curvas con 1x PBS fresco y estéril frío.
  2. Seque suavemente al animal con una toalla de papel para eliminar el líquido amniótico residual y el PBS de la muestra.
  3. Sostenga al animal por el abdomen. Decapitar parcialmente al animal con micro tijeras haciendo una incisión en el cuello ventral. Asegúrese de que los vasos sanguíneos estén cortados, pero que la piel que mantiene la cabeza aún esté unida.
    NOTA: La cabeza debe permanecer unida para que la sangre pueda recogerse del cuerpo y de la cabeza simultáneamente.
  4. Sostenga el cuerpo en un ángulo de 45° con la incisión hacia abajo. Sostenga la minivette (tubo capilar) de 50 μL paralela al sitio de incisión del dique donde la sangre forma una gota. Deje con cuidado que el tubo capilar de 50 μL se llene de sangre.
    NOTA: El tubo capilar x2 o el tubo capilar de 100 μL se pueden utilizar para recolectar hasta ~75 μL de sangre.
  5. Coloque la cabeza en un plato nuevo de 60 mm que contenga 1x PBS frío y estéril para una mayor recolección de tejido (sección 4).
  6. Después de que la sangre esté dentro del tubo capilar, presione el émbolo rápidamente en un tubo de 1,5 ml. Agite el tubo o gírelo rápidamente para asegurarse de que la sangre esté en el fondo del tubo.
  7. Repita para el resto de la camada.
    NOTA: Mantener a las crías en hielo y moverlas rápidamente entre ellas es esencial para reducir el riesgo de coagulación postmortem que limitará el volumen de recolección.
  8. Coagular la sangre a temperatura ambiente durante 30 min.
  9. Centrifugar las muestras de sangre a 4 °C, 16.000 × g durante 20 min.
  10. Transfiera el suero a tubos nuevos de 500 μL con una pipeta de 200 μL, sin alterar la pastilla de células sanguíneas en el fondo del tubo.
    NOTA: El suero debe ser de color pajizo sin residuos rojos. Cada feto debe producir entre 15 y 30 μL de suero.
  11. Almacene el suero recogido a -80 °C.

4. Recolección de cerebro fetal

  1. Mirando a través del microscopio de disección, sostenga el hocico con pinzas curvas y use las pinzas # 5 para despegar cuidadosamente la piel de la tapa del cráneo, manteniéndola unida al hocico para facilitar la sujeción. Ángulo # 5 pinzas a 45 ° en relación con el cráneo, perfore con cuidado la membrana transparente que es el cráneo en desarrollo, desplace las pinzas paralelas al cráneo, insértelas debajo de la tapa del cráneo y luego pelar y pelar hacia un lado. Después de quitar un lado, agarre el lado restante con pinzas # 5 y despegue hacia el otro lado.
  2. Saque suavemente el cerebro del cráneo con una microcuchara y transfiera el cerebro a un plato fresco de 60 mm que contenga 1x PBS frío.
    NOTA: En este punto, se pueden fijar e incrustar cerebros enteros para la inmunotinción. Véase la metodología publicada anteriormente32.
  3. Si el tejido debe congelarse rápidamente para otras aplicaciones moleculares, subdiseccione el área de interés. A continuación se describe el aislamiento del tejido periventricular alrededor de los ventrículos lateral, tercero y cuarto.
    1. Usando las pinzas curvas, sostenga el cerebro en la unión del cerebro posterior y el prosencéfalo con la mano no dominante. Con la mano dominante, sostenga el bisturí con la hoja paralela a la superficie del cerebro. Presione firmemente hacia abajo en la región cortical media (Figura 1).
    2. Todavía sosteniendo el cerebro posterior, haga una segunda incisión delante del cerebro posterior para separarlo del prosencéfalo (Figura 1). En la sección más anterior, busque dos pequeños espacios semicirculares ubicados dentro del plano horizontal, que son los ventrículos laterales. Use las pinzas curvas colocadas en el centro de cada ventrículo para mantener el cerebro en su lugar, diseccione cuidadosamente el revestimiento con pinzas # 5 y retírelo a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 mL.
    3. En la sección media, busque un pequeño espacio lineal en la superficie ventral, que es el tercer ventrículo. Con las pinzas #5, pellizque con cuidado el revestimiento a cada lado de la superficie ventricular, luego retírelo a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL limpio y nuevo.
    4. En la sección más posterior, busca un pequeño espacio lineal en el centro del cerebro posterior, que es el cuarto ventrículo. Diseccione el revestimiento en ambos lados con pinzas # 5, luego retírelo a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL limpio y nuevo.
      NOTA: Si el corte del cerebro posterior no es un corte limpio, el tejido del cuarto ventrículo puede oscurecerse y/o destruirse.
    5. Para los pasos 4.3.2-4.3.4, inmediatamente después de que el tejido se haya colocado en los tubos de microcentrífuga, coloque los tubos rápidamente en un recipiente crioseguro que contenga nitrógeno líquido.
      NOTA: Los tubos se pueden mantener en nitrógeno líquido hasta que se hayan diseccionado las muestras restantes. PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar congelación severa. No meta las manos directamente en nitrógeno líquido y evite salpicaduras.
    6. Coloque los tubos congelados sobre hielo seco y transfiera el pañuelo congelado a un congelador a -80 °C hasta su uso.

Resultados

Para ilustrar la calidad del tejido cerebral obtenido a través de esta técnica, mostramos muestras de cerebros fetales de ratones Nestin-CFPnuc35, inmunoteñidos para GFAP según una técnica previamente reportada32. Las células Nestin+ se observan recubriendo el ventrículo lateral (Figura 2A), con filamentos GFAP+ que se extienden desde la superficie. No observamos diferencias entre l...

Discusión

Los métodos tradicionales para recolectar sangre de ratones incluyen retrobulbar, vena de la cola, vena safena, vena facial y sangrado de la vena yugular 40,41,42. Desafortunadamente, estos métodos no son ideales para la recolección de sangre embrionaria debido al tamaño del animal y a la pequeña y delicada vasculatura. La recolección de sangre a través del drenaje asistido por la graveda...

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

N Brossier cuenta con el apoyo del Programa Francis S. Collins Scholars en Investigación Clínica y Traslacional de Neurofibromatosis financiado por el Programa de Aceleración Terapéutica de Neurofibromatosis (NTAP, Subvención # 210112). Esta publicación fue financiada en parte por el NTAP de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. Apoyo adicional del St. Louis Children's Hospital (FDN-2022-1082 a NMB) y el Centro de Investigación de la Diabetes de la Universidad de Washington en St. Louis (NIH P30 DK020579). La microscopía se realizó mediante el uso del Centro de Imágenes Celulares de la Universidad de Washington (WUCCI), con el apoyo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, el Instituto de Descubrimiento Infantil de la Universidad de Washington y el Hospital Infantil de St. Louis (CDI-CORE-2015-505 y CDI-CORE-2019-813) y la Fundación para el Hospital Judío Barnes (3770 y 4642). Grigori Enikolopov (Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, NY) proporcionógenerosamente 35 ratones Nestin-CFPnuc para una mutación de la línea germinal R681X o C383X 32,38,39 y David Gutmann (Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO). La Figura 1 se creó con BioRender.com.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
#5/45 ForcepsDumont 11251-35tip shape: angled 45°
4200 TapestationAgilentG2991BAVerify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen ContainerThermo Fisher2122Or other cryo-safe container
Control ChowPicoLab5053Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved ForcepsCole ParmerUX-10818-25Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handleCole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection ScissorsElectron microscope sciences72996-015½" (139.7 mm), Straight
GFAP AntibodyAbcamab7260Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11MYCO medical2001T-11#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoonAz ScilabA2Z-VL001stainless steel, autoclavable
Micro scissorsRubis78180-1C3model 1C300
Minivette POCT neutralSarstedt17.2111.050nominal volume: 50 µL, without preparation
NanoropThermo Fisher13-400-519Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic dietResearchdiets.comD12331High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol ReagentThermo FisherTR13421Colorimetric detection
β-actin antibodyCell Signaling8457Dilute 1:1,000.

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