Gleichzeitige Entnahme von fötalem murinem Gehirn und Serum zur Beurteilung der Auswirkungen der mütterlichen Ernährung auf die Ernährung und Neuroentwicklung bei Neurofibromatose Typ 1

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur gleichzeitigen Entnahme von fötalem Hirngewebe sowie hochwertigem, nicht hämolysiertem Serum aus demselben Mausembryo. Wir haben diese Technik verwendet, um zu untersuchen, wie sich die mütterliche Exposition gegenüber der Ernährung auf Makronährstoffprofile und die fetale Neuroentwicklung bei Mäusen auswirkt, die heterozygot für Nf1 (Neurofibromatose Typ 1) sind.

Zusammenfassung

Es wurde gezeigt, dass ernährungsbedingte Fettleibigkeit der Mutter die neurologische Entwicklung der Nachkommen verändert, was zu einer verminderten kognitiven Kapazität, Hyperaktivität und Beeinträchtigungen des Sozialverhaltens führen kann. Patientinnen mit der klinisch heterogenen genetischen Störung Neurofibromatose Typ 1 (NF1) können ähnliche Defizite aufweisen, aber es ist derzeit unklar, ob Umweltfaktoren wie die Ernährung der Mutter die Entwicklung dieser Phänotypen beeinflussen und wenn ja, durch welchen Mechanismus ein solcher Effekt auftreten würde. Um beurteilen zu können, wie sich die Exposition der Mutter gegenüber einer fett- und saccharosereichen Ernährung auf systemische Faktoren auswirkt, die für die Neuroentwicklung bei NF1 relevant sind, haben wir eine Methode entwickelt, um gleichzeitig nicht-hämolysiertes Serum und ganze oder regional mikropräparierte Gehirne von fötalen Nachkommen von murinen Muttertieren zu sammeln, die mit einer Kontrolldiät im Vergleich zu einer fett- und saccharosereichen Diät gefüttert wurden. Die Gehirne wurden für die Kryosektion aufbereitet oder schockgefroren, um sie für die anschließende RNA- oder Proteinisolierung zu verwenden. Die Qualität des entnommenen Gewebes wurde durch Immunfärbung verifiziert. Die Qualität des Serums wurde durch die Analyse von Makronährstoffprofilen verifiziert. Mit dieser Technik haben wir festgestellt, dass die mütterliche fettleibige Ernährung das fetale Serumcholesterin bei WT- und Nf1-heterozygoten Welpen in ähnlicher Weise erhöht.

Einleitung

Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) gilt als RASopathie, eine Gruppe von Erkrankungen, die durch genetische Mutationen in der Keimbahn gekennzeichnet sind, die zu einer Aktivierung des RAS/MAPK-Signalwegs (RAt-Sarkomvirus/Mitogen-aktivierte Proteinkinase) führen. Bei Patienten mit der NF1-RASopathie besteht das Risiko für die Entwicklung vieler verschiedener Manifestationen, darunter sowohl gutartige als auch bösartige Tumoren des zentralen (Gliom ^1,2 der Sehbahn, hochgradiges Gliom ^3,4) und peripheren (plexiformes Neurofibrom ^5,6, bösartiger peripherer Nervenscheidentumor ^7,8) des Nervensystems sowie knöcherne Dysplasien⁹ und Pigmentstörungen der Haut¹⁰ (Sommersprossen der Achsel, Café-au-lait-Makula). Die Auswirkungen dieser Störung auf die Kognition und die neurologische Entwicklung werden zunehmend erkannt, wobei NF1-Patienten eine erhöhte Inzidenz von Lerndefiziten, Hyperaktivität und Autismus-Spektrum-Störung aufweisen 11,12,13. Es gibt jedoch eine signifikante Heterogenität in der Entwicklung dieser Phänotypen zwischen den Patienten 13,14,15,16,17, und es ist unklar, warum einige Patienten signifikante kognitive Beeinträchtigungen aufweisen, während andere nicht betroffen sind. Es hat sich gezeigt, dass ernährungsbedingte Fettleibigkeit der Mutter das Lernen und Verhalten in der Allgemeinbevölkerung in ähnlicher Weise beeinflusst 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, was darauf hindeutet, dass die unterschiedliche ernährungsbedingte Exposition der Mütter bei NF1 eine Ursache für diese klinische Heterogenität sein könnte. Insbesondere Kinder von adipösen Müttern weisen ein erhöhtes Risiko auf, Hyperaktivität zu entwickeln 18,19,20,23,25,26, Autismus 19,24,27, Defizite der exekutiven Funktionen ^21,23 und niedrigere IQ-Werte^22,28. Patienten mit NF1 haben jedoch im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung veränderte metabolische Phänotypen, einschließlich einer verringerten Inzidenz von Fettleibigkeit und Diabetes 29,30,31, was es unklar macht, ob sie ähnlich auf diätetische Reize reagieren würden.

Um diese Fragen zu beantworten, wollten wir herausfinden, ob durch eine amöogene Ernährung induzierte Veränderungen des Makronährstoffprofils bei fetalen Nachkommen mit Nf1 zu Veränderungen der neurologischen Entwicklung beitragen. Wir haben zuvor hochwertiges ganzes und regional mikropräpariertes Gewebe aus dem Gehirn des Fötus gesammelt, das für Anwendungen in der neurologischen Entwicklung geeignet ist³². Die Blutentnahme am Fötus ist jedoch aufgrund der geringen Körpergröße und des geringen Blutvolumens eine Herausforderung³³. Die Entnahme von Blut über eine schwerkraftgestützte Drainage nach der Enthauptung führte zu geringen Entnahmevolumina und einer signifikanten Hämolyse in unseren Proben, was sich auf die Interpretation der nachgelagerten Anwendung auswirken kann. Die Entnahme durch Aspiration aus dem fetalen Herzen oder den thorakalen Gefäßen, wie bereits berichtet wurde³³, war technisch anspruchsvoll und führte auch zu einer häufigen Hämolyse. Aus diesem Grund haben wir eine Methode zur fetalen Serumentnahme entwickelt, bei der spezielle Kapillarröhrchen verwendet werden, um eine Entnahme mit höherem Volumen ohne signifikante Scherbelastung zu ermöglichen.

Hier stellen wir diese Methode vor, um gleichzeitig embryonale Gehirne und fetales Serum von Nf1-heterozygoten Welpen zu sammeln, die einer fett- und zuckerreichen Diät im Vergleich zu einer Kontrolldiät in utero ausgesetzt waren (Abbildung 1 und ergänzende Tabelle S1). Die Gehirne wurden für die anschließende Analyse durch Immunfluoreszenz kryoeingebettet oder regional mikropräpariert und schockgefroren für die anschließende Verwendung in molekularbiologischen Anwendungen. Es wurde hochwertiges Serum gewonnen, das sich für nachgelagerte Anwendungen wie die Erstellung von Makronährstoffprofilen eignet. Mit dieser Methode haben wir festgestellt, dass eine mütterliche Exposition mit hohem Fett- und Saccharosegehalt zu einem Anstieg des Serumcholesterinspiegels sowohl bei WT- als auch bei Nf1-heterozygoten Welpen führt.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie folgten den NIH-Richtlinien und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Washington University in St. Louis genehmigt. Die Tiere wurden mit standardmäßigem 12-stündigem Hell-Dunkel-Radfahren und freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.

1. Ernährung der Mutter

1. Setzen Sie weibliche Mäuse im Alter von 4 Wochen auf Kontrollfutter (CD) oder fettleibige Diät (Ob).
2. Richten Sie im Alter von 8-12 Wochen eine zeitgesteuerte Paarung ein, indem Sie den Schleimpfropfen des Muttertiers am frühen Morgen überwachen, um das richtige Entnahmealter zu bestimmen. Um ernährungsbedingte Fettleibigkeit zu überprüfen, wiegen Sie Weibchen bei der Paarung.
   HINWEIS: Für die anfängliche Paarung wurde ein Zeitraum von 8-12 Wochen verwendet, um sicherzustellen, dass die mit fettleibigem Futter gefütterten Weibchen im Vergleich zu ihren Artgenossen übergewichtig waren, was nicht immer im Alter von 8 Wochen der Fall war. Der Tag des Plugs gilt als embryonaler Tag 1 (E1), und alle in dieser Studie verwendeten Tiere wurden bei E19 gesammelt. Der späte fetale Zeitpunkt wurde aufgrund von neurologischen Entwicklungsveränderungen gewählt, die zuvor zu diesem Zeitpunkt bei fettleibigen, der Ernährung exponierten Tieren beobachtet worden waren (Daten nicht gezeigt).

2. Entnahme des Fötus aus dem Damm

1. Stellen Sie zunächst sicher, dass das Muttertier trächtig erscheint (Bauchform und -fülle, abdominale Palpation oder Bewegung des Fötus). Im Zweifelsfall wiegen Sie die Hündin erneut, um die Gewichtszunahme zu messen.
   HINWEIS: Spät schwangere Mäuse sollten eine Gewichtszunahme von mindestens 3-4 g aufweisen. Um die Wahrscheinlichkeit einer Empfängnis im gewünschten Zeitrahmen zu erhöhen, kann schmutziges (urin- und pheromonhaltiges) Sägemehl aus dem Käfig eines Männchens 3 Tage lang täglich vor der Paarung in den Käfig des Weibchens gegeben werden, um Brunst³⁴ auszulösen.
2. Euthanasiere den Damm, indem du ihn mit einem Papiertuch mit 3 ml Isofluran in eine Kammer legst, wobei darauf zu achten ist, dass kein direkter Kontakt zwischen dem Muttertier und dem anästhesiegetränkten Papiertuch entsteht. Nachdem das Tier sediert ist, legen Sie es auf ein Papiertuch, halten Sie es am Schwanz fest, platzieren Sie eine Präparierschere am Hals und drücken Sie dann die Schere nach oben in Richtung Kopf, um eine Gebärmutterhalsluxation durchzuführen. Alternativ können Sie nach einer Isofluran-Sedierung eine Enthauptung durchführen.
   HINWEIS: In diesem Schritt kann das Serum aus dem Mutterkorn entnommen werden, wobei eine ähnliche Methode wie unten beschrieben angewendet wird, jedoch mit größeren Kapillarröhrchen. Wenn dies gewünscht ist, sollte eine Enthauptung anstelle einer Gebärmutterhalsluxation durchgeführt werden. Es sollte darauf geachtet werden, dass der interessierende Phänotyp durch die Verabreichung von Isofluran unmittelbar vor der Euthanasie nicht verändert wird.
3. Legen Sie den Damm mit der Bauchseite nach oben in eine 100 mm Schale. Kneifen Sie die Haut zusammen, die den Bauch bedeckt, und machen Sie mit einer Präparierschere einen Schnitt in der Mittellinie. Machen Sie zusätzliche Schnitte senkrecht zum Mittellinienschnitt, um Hautlappen zu schaffen, die die Gebärmutter mit den Embryonen freilegen.
4. Ziehe die Gebärmutter aus der Bauchhöhle. Trennen Sie die Gebärmutter mit einer Schere vom Muttertier. Legen Sie den intakten Embryonalsack ("Perlen an einer Schnur") mit den Embryonen in eine Schale mit kaltsteriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Stellen Sie die Schale mit den Föten auf Eis.
   HINWEIS: Da jeder Wurf in der Regel 6-10 Jungtiere enthält, die sowohl für das Gehirn als auch für das Serum entnommen werden, werden die Föten auf Eis gehalten, um einen Gewebeabbau zu vermeiden. Das Setzen von Welpen auf Eis gewährleistet zusätzlich eine angemessene Euthanasie der Welpen, da die mütterliche Euthanasie allein nicht immer ausreicht. Wenn nur eine Serumentnahme gewünscht wird, kann eine Entnahme bei Raumtemperatur bevorzugt werden.

3. Sammlung von fötalem Serum

1. Entferne den Fötus aus dem Embryonalsack, indem du ihn vorsichtig mit einer Pinzette #5 präparierst. Übertragen Sie den Embryo mit einer gebogenen Pinzette in eine Schale mit frischem, kaltem, sterilem 1x PBS.
2. Tupfen Sie das Tier vorsichtig auf ein Papiertuch, um Fruchtwasserreste und PBS von der Probe zu entfernen.
3. Halten Sie das Tier am Bauch fest. Enthaupten Sie das Tier teilweise mit einer Mikroschere, indem Sie einen Schnitt am Bauchhals machen. Stellen Sie sicher, dass die Blutgefäße durchtrennt sind, aber die Haut, die den Kopf hält, noch befestigt ist.
   HINWEIS: Der Kopf muss befestigt bleiben, damit gleichzeitig Blut aus dem Körper und dem Kopf entnommen werden kann.
4. Halten Sie den Körper in einem Winkel von 45° mit dem Schnitt nach unten. Halten Sie die 50 μL Minivette (Kapillarröhrchen) parallel zur Inzisionsstelle des Mutters, wo das Blut einen Tropfen bildet. Lassen Sie das 50 μL Kapillarröhrchen vorsichtig mit Blut füllen.
   HINWEIS: Das Kapillarröhrchen x2 oder das 100 μl Kapillarröhrchen kann verwendet werden, um bis zu ~75 μl Blut zu sammeln.
5. Legen Sie den Kopf in eine frische 60-mm-Schale mit kaltem, sterilem 1x PBS für die weitere Gewebeentnahme (Abschnitt 4).
6. Nachdem sich das Blut im Kapillarröhrchen befindet, drücken Sie den Kolben schnell in ein 1,5-ml-Röhrchen. Schnippe an der Tube oder drehe sie schnell, um sicherzustellen, dass sich das Blut am Boden der Tube befindet.
7. Wiederholen Sie dies für den Rest der Einstreu.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Welpen auf Eis zu halten und schnell zwischen ihnen zu wechseln, um das Risiko einer postmortalen Gerinnung zu verringern, die das Entnahmevolumen begrenzt.
8. Das Blut bei Raumtemperatur 30 min gulinieren lassen.
9. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 4 °C, 16.000 × g für 20 min.
10. Füllen Sie das Serum mit einer 200-μl-Pipette in frische 500-μl-Röhrchen um, ohne das Blutzellenpellet am Boden des Röhrchens zu stören.
    HINWEIS: Das Serum sollte strohfarben sein und keine roten Ablagerungen enthalten. Jeder Fötus sollte 15-30 μl Serum abgeben.
11. Lagern Sie das gesammelte Serum bei -80 °C.

4. Entnahme des fetalen Gehirns

1. Schauen Sie durch das Präpariermikroskop, halten Sie die Schnauze mit einer gebogenen Pinzette fest und ziehen Sie mit der Pinzette #5 vorsichtig die Haut von der Schädelkappe ab, wobei Sie sie an der Schnauze befestigt halten, damit sie leichter gehalten werden kann. Winkeln Sie die Pinzette #5 um 45° relativ zum Schädel, durchstechen Sie vorsichtig die klare Membran, die der sich entwickelnde Schädel ist, verschieben Sie die Pinzette parallel zum Schädel, führen Sie sie unter die Schädelkappe ein und kneifen und schälen Sie sie dann zur Seite. Nachdem eine Seite entfernt wurde, fassen Sie die verbleibende Seite mit der Pinzette #5 und schälen Sie sie zur anderen Seite.
2. Schöpfen Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Mikrolöffel aus dem Schädel und geben Sie das Gehirn in eine frische 60-mm-Schale mit kaltem 1x PBS.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können ganze Gehirne fixiert und für die Immunfärbung eingebettet werden. Siehe die zuvor veröffentlichte Methodik³².
3. Wenn Gewebe für andere molekulare Anwendungen schockgefroren werden muss, zerlegen Sie den interessierenden Bereich. Die Isolierung des periventrikulären Gewebes um den lateralen, dritten und vierten Ventrikel wird im Folgenden beschrieben.
   1. Halten Sie das Gehirn mit der gebogenen Pinzette an der Verbindung von Hinterhirn und Vorderhirn mit der nicht dominanten Hand. Halten Sie mit der dominanten Hand das Skalpell mit der Klinge parallel zur Oberfläche des Gehirns. Drücken Sie in der mittleren kortikalen Region fest nach unten (Abbildung 1).
   2. Halten Sie das Hinterhirn fest und machen Sie einen zweiten Schnitt vor dem Hinterhirn, um es vom Vorderhirn zu trennen (Abbildung 1). Suchen Sie im vordersten Abschnitt nach zwei kleinen halbkreisförmigen Räumen in der horizontalen Ebene, die die lateralen Ventrikel sind. Verwenden Sie die gebogene Pinzette, die in der Mitte jedes Ventrikels platziert ist, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten, präparieren Sie die Auskleidung vorsichtig mit der Pinzette #5 und nehmen Sie sie in ein frisches, sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Suchen Sie im mittleren Abschnitt nach einem kleinen linearen Raum auf der ventralen Fläche, dem dritten Ventrikel. Mit der Pinzette #5 das Futter auf beiden Seiten der Ventrikeloberfläche vorsichtig abkneifen und dann in ein frisches, sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben.
   4. Suchen Sie im hintersten Abschnitt nach einem kleinen linearen Raum in der Mitte des Hinterhirns, dem vierten Ventrikel. Präparieren Sie die Auskleidung auf beiden Seiten mit einer Pinzette #5 und nehmen Sie sie dann in ein frisches, sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Wenn das Schneiden des Hinterhirns kein sauberer Schnitt ist, kann das Gewebe des vierten Ventrikels verdeckt und/oder zerstört werden.
   5. Für die Schritte 4.3.2 bis 4.3.4 werden die Röhrchen unmittelbar nach dem Einlegen des Gewebes in Mikrozentrifugenröhrchen schnell in einen kryosicheren Behälter mit flüssigem Stickstoff gegeben.
      HINWEIS: Die Röhrchen können in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, bis die restlichen Proben präpariert wurden. ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann schwere Erfrierungen verursachen. Halten Sie die Hände nicht direkt in flüssigen Stickstoff und vermeiden Sie Spritzer.
   6. Legen Sie die gefrorenen Röhrchen auf Trockeneis und geben Sie das gefrorene Gewebe bis zur Verwendung in einen Gefrierschrank bei -80 °C.

Ergebnisse

Um die Qualität des mit dieser Technik gewonnenen Hirngewebes zu veranschaulichen, zeigen wir Probengehirne von Nestin-CFPnuc-Mäusen³⁵, die gemäß einer zuvor berichteten Technik³² auf GFAP immungefärbt wurden. Nestin⁺-Zellen sind zu sehen, die den lateralen Ventrikel auskleiden (Abbildung 2A), wobei GFAP⁺-Filamente von der Oberfläche ausgehen. Wir beobachteten keine Unterschiede zwis...

Diskussion

Zu den traditionellen Methoden zur Blutentnahme von Mäusen gehören retrobulbäre Blutungen, Schwanzvenen, Stammvenen, Gesichtsvenen und Halsvenenblutungen 40,41,42. Leider sind diese Methoden aufgrund der Größe des Tieres und der kleinen, empfindlichen Gefäße nicht ideal für die embryonale Blutentnahme. Die Entnahme von Blut durch schwerkraftgestützte Drainage nach der Enthauptung führt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.