Gleichzeitige Entnahme von fötalem murinem Gehirn und Serum zur Beurteilung der Auswirkungen der mütterlichen Ernährung auf die Ernährung und Neuroentwicklung bei Neurofibromatose Typ 1

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur gleichzeitigen Entnahme von fötalem Hirngewebe sowie hochwertigem, nicht hämolysiertem Serum aus demselben Mausembryo. Wir haben diese Technik verwendet, um zu untersuchen, wie sich die mütterliche Exposition gegenüber der Ernährung auf Makronährstoffprofile und die fetale Neuroentwicklung bei Mäusen auswirkt, die heterozygot für Nf1 (Neurofibromatose Typ 1) sind.

Zusammenfassung

Es wurde gezeigt, dass ernährungsbedingte Fettleibigkeit der Mutter die neurologische Entwicklung der Nachkommen verändert, was zu einer verminderten kognitiven Kapazität, Hyperaktivität und Beeinträchtigungen des Sozialverhaltens führen kann. Patientinnen mit der klinisch heterogenen genetischen Störung Neurofibromatose Typ 1 (NF1) können ähnliche Defizite aufweisen, aber es ist derzeit unklar, ob Umweltfaktoren wie die Ernährung der Mutter die Entwicklung dieser Phänotypen beeinflussen und wenn ja, durch welchen Mechanismus ein solcher Effekt auftreten würde. Um beurteilen zu können, wie sich die Exposition der Mutter gegenüber einer fett- und saccharosereichen Ernährung auf systemische Faktoren auswirkt, die für die Neuroentwicklung bei NF1 relevant sind, haben wir eine Methode entwickelt, um gleichzeitig nicht-hämolysiertes Serum und ganze oder regional mikropräparierte Gehirne von fötalen Nachkommen von murinen Muttertieren zu sammeln, die mit einer Kontrolldiät im Vergleich zu einer fett- und saccharosereichen Diät gefüttert wurden. Die Gehirne wurden für die Kryosektion aufbereitet oder schockgefroren, um sie für die anschließende RNA- oder Proteinisolierung zu verwenden. Die Qualität des entnommenen Gewebes wurde durch Immunfärbung verifiziert. Die Qualität des Serums wurde durch die Analyse von Makronährstoffprofilen verifiziert. Mit dieser Technik haben wir festgestellt, dass die mütterliche fettleibige Ernährung das fetale Serumcholesterin bei WT- und Nf1-heterozygoten Welpen in ähnlicher Weise erhöht.

Einleitung

Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) gilt als RASopathie, eine Gruppe von Erkrankungen, die durch genetische Mutationen in der Keimbahn gekennzeichnet sind, die zu einer Aktivierung des RAS/MAPK-Signalwegs (RAt-Sarkomvirus/Mitogen-aktivierte Proteinkinase) führen. Bei Patienten mit der NF1-RASopathie besteht das Risiko für die Entwicklung vieler verschiedener Manifestationen, darunter sowohl gutartige als auch bösartige Tumoren des zentralen (Gliom ^1,2 der Sehbahn, hochgradiges Gliom ^3,4) und peripheren (plexiformes Neurofibrom^<....

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie folgten den NIH-Richtlinien und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Washington University in St. Louis genehmigt. Die Tiere wurden mit standardmäßigem 12-stündigem Hell-Dunkel-Radfahren und freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.

1. Ernährung der Mutter

1. Setzen Sie weibliche Mäuse im Alter von 4 Wochen auf Kontrollfutter (CD) oder fettleibige Diät (Ob).
2. Richten Sie im Alter von 8-12 Wochen eine zeitgesteuerte Paarung ein, indem Sie den Schleimpfropfen des Muttertiers am frühen Morgen über....

Diskussion

Zu den traditionellen Methoden zur Blutentnahme von Mäusen gehören retrobulbäre Blutungen, Schwanzvenen, Stammvenen, Gesichtsvenen und Halsvenenblutungen 40,41,42. Leider sind diese Methoden aufgrund der Größe des Tieres und der kleinen, empfindlichen Gefäße nicht ideal für die embryonale Blutentnahme. Die Entnahme von Blut durch schwerkraftgestützte Drainage nach der Enthauptung führt.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.