同时收集胎鼠大脑和血清以评估母体饮食对 1 型神经纤维瘤病营养和神经发育的影响

摘要

在该方案中，我们描述了一种同时收集胎儿脑组织以及来自同一小鼠胚胎的高质量、非溶血血清的方法。我们利用这项技术来询问母体饮食暴露如何影响 Nf1 杂合子小鼠的常量营养素谱和胎儿神经发育（1 型神经纤维瘤病）。

摘要

母亲饮食诱导的肥胖已被证明会改变后代的神经发育，这可能导致认知能力下降、多动症和社交行为受损。患有临床异质性遗传病 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 的患者可能表现出类似的缺陷，但目前尚不清楚环境因素（如母体饮食）是否会影响这些表型的发展，如果是，这种影响的发生机制。为了能够评估母体致肥胖饮食暴露如何影响与 NF1 神经发育相关的全身因素，我们开发了一种方法，可以同时收集来自饲喂对照饮食与高脂肪、高蔗糖饮食的小鼠母细胞胎儿后代的非溶血血清和整个或区域显微解剖的大脑。对大脑进行冷冻切片或快速冷冻，用于后续的 RNA 或蛋白质分离;通过免疫染色验证收集的组织质量。通过分析常量营养素谱来验证血清的质量。使用这种技术，我们确定母体肥胖饮食在 WT 和 Nf1 杂合子幼崽之间增加胎儿血清胆固醇的方式相似。

引言

1 型神经纤维瘤病 （NF1） 被认为是一种 RASopathy，这是一组以种系基因突变为特征的疾病，导致 RAS/MAPK（RAt 肉瘤病毒/丝裂原活化蛋白激酶）信号通路激活。患有 NF1 RASopathy 的患者有发展许多不同表现的风险，包括中枢（视路神经胶质瘤 ^1,2，高级别神经胶质瘤 ^3,4）和外周（丛状神经纤维瘤 ^5,6，恶性周围神经鞘瘤 ^7,8）神经系统的良性和恶性肿瘤，以及骨发育不良 9 和皮肤色素异常 ¹⁰（腋窝雀斑、牛奶咖啡斑）。这种疾病对认知和神经发育的影响越来越受到认可，NF1 患者表现出学习缺陷、多动症和自闭症谱系障碍的发生率增加 11,12,13。然而，患者^{13、14、15、16、17} 之间这些表型的发展存在显着异质性，目前尚不清楚为什么一些患者表现出显着的认知障碍而另一些患者不受影响。母亲饮食诱导的肥胖已被证明同样会影响普通人群的学习和行为 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28，表明 NF1 中母亲膳食暴露的差异可能是这种临床异质性的来源之一。特别是，肥胖母亲的孩子患多动症的风险增加 18,19,20,23,25,26，自闭症 19,24,27，执行功能缺陷^21,23，并且全程智商分数较低 ^22,28.然而，与一般人群相比，NF1 患者的代谢表型发生了变化，包括肥胖和糖尿病的发生率降低 29,30,31，因此尚不清楚他们是否会对饮食刺激做出类似的反应。

为了回答这些问题，我们希望确定肥胖饮食诱导的 Nf1 胎儿后代宏量营养素谱的变化是否有助于神经发育变化。我们之前已经从胎脑中收集了适用于神经发育应用的高质量完整和区域显微解剖组织³²。然而，由于体型小和血容量低，胎儿血液采集具有挑战性³³。斩首后通过重力辅助引流采集血液导致样品采集量低和大量溶血，这会影响下游应用的解释。如前所述³³，通过从胎儿心脏或胸血管抽吸收集，在技术上具有挑战性，并且还会导致频繁的溶血。因此，我们开发了一种胎儿血清采集方法，该方法利用专门的毛细管来允许更高体积的采集，而不会产生明显的剪切应力。

在这里，我们提出了这种方法，以同时从暴露于高脂肪、高糖饮食与子宫内对照饮食的 Nf1 杂合子幼仔中收集胚胎大脑和胎儿血清（图 1 和补充表 S1）。将脑冷冻包埋以通过免疫荧光进行后续分析，或进行区域显微解剖和快速冷冻，以便随后用于分子生物学应用。获得高质量的血清，适用于宏量营养素分析等下游应用。利用这种方法，我们确定母体高脂肪、高蔗糖饮食暴露导致 WT 和 Nf1 杂合子幼仔血清胆固醇水平升高。

研究方案

本研究中的所有动物程序均遵循 NIH 指南，并获得了圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的批准。动物以标准的 12 小时光照:黑暗循环和自由获取食物和水进行饲养。

1. 产妇饮食

1. 在 4 周龄时将雌性小鼠置于对照食物 （CD） 或致肥胖饮食 （Ob） 中。
2. 在 8-12 周龄时，通过在清晨监测母鼠的粘液栓来确定正确的收集年龄，从而设置定时交配。为了验证饮食引起的肥胖，请在交配时称量雌性。
   注意:初始交配设置使用 8-12 周的范围，以确保肥胖饮食喂养的雌性与同类相比超重，这并不总是发生在 8 周龄之前。塞子的那一天被认为是胚胎第 1 天 （E1），本研究中使用的所有动物均在 E19 收集。选择晚期胎儿时间点是由于先前在此时在肥胖饮食暴露的动物中观察到的神经发育变化（数据未显示）。

2. 从母带中取出胎儿

1. 首先，确保母带看起来是妊娠的（腹部形状和丰满度、腹部触诊或胎动）。如有疑问，请再次称量雌性体重以测量体重增加。
   注意:晚期怀孕的小鼠应显示至少 3-4 g 的体重增加。为了增加在所需时间范围内受孕的可能性，可以在交配前 3 天每天将雄性笼子中的脏（含有尿液和信息素）锯末添加到雌性笼子中以诱导发情³⁴。
2. 将分流管放入装有 3 mL 异氟醚的纸巾的腔室中，对分流管实施安乐死，注意避免分流管与浸有麻醉剂的纸巾直接接触。动物镇静后，将其放在纸巾上，握住它的尾巴，将解剖剪刀放在颈部，然后用力将剪刀向上朝向头部进行颈椎脱位。或者，在异氟醚镇静后进行斩首。
   注:在此步骤中，可以使用如下所述的类似方法从dam中收集血清，但使用更大的毛细管。如果需要，应进行斩首而不是颈椎脱位。应注意确保在安乐死前立即施用异氟醚不会改变感兴趣的表型。
3. 将挡板腹侧朝上放入 100 毫米的培养皿中。捏住覆盖腹部的皮肤，用解剖剪刀做一个中线切口。在垂直于中线切口的地方做额外的切口，形成皮瓣，露出含有胚胎的子宫。
4. 将子宫从腹腔中拉出。使用剪刀断开子宫与母膜的连接。将含有胚胎的完整胚胎囊（"绳子上的珍珠"）放入装有冷无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的培养皿中。将胎儿培养皿放在冰上。
   注意:由于每窝通常包含 6-10 只幼崽，这些幼崽将被收获用于大脑和血清，因此将胎儿保存在冰上以避免组织降解。将幼崽放在冰上还可以确保对幼崽进行充分的安乐死，因为仅靠母体安乐死可能并不总是足够的。如果只需要收集血清，则可能首选室温收集。

3. 胎液采集

1. 用 #5 镊子小心解剖，从胚囊中取出胎儿。使用弯曲的镊子和新鲜的冷无菌 1x PBS 将胚胎转移到培养皿中。
2. 用纸巾轻轻吸干动物，以去除标本中残留的羊水和 PBS。
3. 握住动物的腹部。通过在腹侧颈部切开，用微型剪刀将动物部分斩首。确保血管被切断，但保持头部的皮肤仍然附着在身上。
   注意:头部必须保持连接状态，以便可以同时从身体和头部收集血液。
4. 将身体保持 45° 角，切口朝下。将 50 μL minivette（毛细管）平行于血滴形成液滴的母带切口部位。小心地让 50 μL 毛细管充满血液。
   注:毛细管 x2 或 100 μL 毛细管可用于采集多达 ~75 μL 的血液。
5. 将头部放入含有冷的无菌 1x PBS 的新鲜 60 mm 培养皿中，以便进一步收集组织（第 4 节）。
6. 血液进入毛细管后，将柱塞快速压入 1.5 mL 管中。轻弹管子或快速旋转管子，确保血液在管子底部。
7. 对剩余的垃圾重复此操作。
   注意:将幼崽保持在冰上并在冰上快速移动对于降低死后凝血的风险至关重要，因为死后凝血会限制收集量。
8. 在室温下凝固血液 30 分钟。
9. 将血液样品在 4 °C、16,000 × g 下离心 20 分钟。
10. 用 200 μL 移液器将血清转移至新鲜的 500 μL 试管中，而不会干扰试管底部的血细胞沉淀。
    注意:血清应为稻草色，无红色碎屑。每个胎儿应产生 15-30 μL 血清。
11. 将收集的血清储存在 -80 °C。

4. 胎脑采集

1. 通过解剖显微镜观察，用弯曲的镊子握住鼻子，并使用 #5 镊子小心地从颅骨帽上剥下皮肤，使其附着在鼻子上以便于握住。将 #5 镊子相对于颅骨倾斜 45°，小心地刺穿作为发育中的颅骨的透明膜，将镊子平行于颅骨移动，将其插入颅骨帽下方，然后捏住并剥离到一侧。去除一侧后，用 #5 镊子抓住另一侧并剥到另一侧。
2. 用微型勺子轻轻地将大脑从颅骨中舀出，然后将大脑转移到含有冷 1x PBS 的新鲜 60 毫米培养皿中。
   注意:此时，可以固定和包埋整个大脑以进行免疫染色。见以前发表的方法³².
3. 如果组织必须快速冷冻才能用于其他分子应用，请对感兴趣区域进行子解剖。外侧脑室、第三脑室和第四脑室周围脑室组织的分离见下文。
   1. 使用弯曲的镊子，用非惯用手将大脑保持在后脑和前脑的交界处。用惯用手握住手术刀，刀片平行于大脑表面。用力按压皮质中部区域（图 1）。
   2. 仍然握住后脑，在后脑前面做第二个切口，将其与前脑分开（图 1）。在最前面的部分，寻找位于水平面内的两个小半圆形空间，即侧脑室。使用放置在每个心室中心的弯曲镊子将大脑固定到位，使用 #5 镊子仔细解剖衬里，然后取出到新鲜干净的 1.5 mL 微量离心管中。
   3. 在中间部分，在腹面上寻找一个小的线性空间，即第三脑室。使用 #5 镊子，小心地捏掉心室表面两侧的衬里，然后取出到新鲜干净的 1.5 mL 微量离心管中。
   4. 在最后部分，寻找后脑中央的一个小线性空间，即第四脑室。使用 #5 镊子解剖两侧的衬里，然后取出到新鲜干净的 1.5 mL 微量离心管中。
      注意:如果切开后脑不是一个干净的切口，第四脑室组织可能会被遮挡和/或破坏。
   5. 对于步骤 4.3.2-4.3.4，将组织放入微量离心管后，立即将管快速放入含有液氮的冷冻安全容器中。
      注:试管可保存在液氮中，直到解剖完剩余的样品。注意:液氮会导致严重的冻伤。请勿将手直接伸入液氮中，避免飞溅。
   6. 将冷冻管放在干冰上，并将冷冻组织转移到 -80 °C 冰箱中直至使用。

结果

为了说明通过该技术获得的脑组织质量，我们展示了来自 Nestin-CFPnuc 小鼠³⁵ 的胎儿大脑样本，根据先前报道的技术³² 进行 GFAP 免疫染色。可以看到 Nestin ⁺ 细胞排列在侧脑室内（图 2A），GFAP⁺ 细丝从表面延伸。在 WT 或 Nf1 杂合菌株中，我们没有观察到 CD 侧脑室与 Ob 暴露小鼠中 Nestin 或 GFAP 表...

讨论

从小鼠采集血液的传统方法包括球后、尾静脉、大隐静脉、面静脉和颈静脉出血 40,41,42。不幸的是，由于动物的大小和细小而脆弱的脉管系统，这些方法对于胚胎血液采集并不理想。斩首后通过重力辅助引流收集血液导致我们的样本采集量低和大量溶血。以前的方案报告了使用改良的 20 G 针头从胸血?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.