同时收集胎鼠大脑和血清以评估母体饮食对 1 型神经纤维瘤病营养和神经发育的影响

摘要

在该方案中，我们描述了一种同时收集胎儿脑组织以及来自同一小鼠胚胎的高质量、非溶血血清的方法。我们利用这项技术来询问母体饮食暴露如何影响 Nf1 杂合子小鼠的常量营养素谱和胎儿神经发育（1 型神经纤维瘤病）。

摘要

母亲饮食诱导的肥胖已被证明会改变后代的神经发育，这可能导致认知能力下降、多动症和社交行为受损。患有临床异质性遗传病 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 的患者可能表现出类似的缺陷，但目前尚不清楚环境因素（如母体饮食）是否会影响这些表型的发展，如果是，这种影响的发生机制。为了能够评估母体致肥胖饮食暴露如何影响与 NF1 神经发育相关的全身因素，我们开发了一种方法，可以同时收集来自饲喂对照饮食与高脂肪、高蔗糖饮食的小鼠母细胞胎儿后代的非溶血血清和整个或区域显微解剖的大脑。对大脑进行冷冻切片或快速冷冻，用于后续的 RNA 或蛋白质分离;通过免疫染色验证收集的组织质量。通过分析常量营养素谱来验证血清的质量。使用这种技术，我们确定母体肥胖饮食在 WT 和 Nf1 杂合子幼崽之间增加胎儿血清胆固醇的方式相似。

引言

1 型神经纤维瘤病 （NF1） 被认为是一种 RASopathy，这是一组以种系基因突变为特征的疾病，导致 RAS/MAPK（RAt 肉瘤病毒/丝裂原活化蛋白激酶）信号通路激活。患有 NF1 RASopathy 的患者有发展许多不同表现的风险，包括中枢（视路神经胶质瘤 ^1,2，高级别神经胶质瘤 ^3,4）和外周（丛状神经纤维瘤 ^5,6，恶性周围神经鞘瘤 ^7,8）神经系统的良性和恶性肿瘤，以及骨发育不良 9 和皮肤色素异常 ¹⁰（腋窝雀斑、牛奶咖啡斑）。这种疾病对认知和神经发育的影响越来越受到认可，NF1 患者表现出学习缺陷、多动症和自闭症谱系障碍的发生率增加 11,12,13。

研究方案

本研究中的所有动物程序均遵循 NIH 指南，并获得了圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的批准。动物以标准的 12 小时光照：黑暗循环和自由获取食物和水进行饲养。

1. 产妇饮食

1. 在 4 周龄时将雌性小鼠置于对照食物 （CD） 或致肥胖饮食 （Ob） 中。
2. 在 8-12 周龄时，通过在清晨监测母鼠的粘液栓来确定正确的收集年龄，从而设置定时交配。为了验证饮食引起的肥胖，请在交配时称量雌性。
   注意：初始交配设置使用 8-12 周的范围，以确保肥胖饮食喂养的雌性与同类相比超重，这并不总是发生在 8 周龄之前。塞子的那一天被认为是胚胎第 1 天 （E1），本研究中使用的所有动物均在 E19 收集。选择晚期胎儿时间点是由于先前在此时在肥胖饮食暴露的动物中观察到的神经发育变化（数据未显示）。

2. 从母带中取出胎儿

1. 首先，确保母带看起来是妊娠的（腹部形状和丰满度、腹部触诊或胎动）。如有疑问，请再次称量雌性体重以测量体重增加。
   注意：晚期怀孕的小鼠应显示至少 3-4 g 的体重增加。为了增加在所需时间范围内受孕的可能性，可以在交配前 3 天每天将雄性笼子中的脏（含有尿液和信息素）锯末添加到雌性笼子中以诱导发情

讨论

从小鼠采集血液的传统方法包括球后、尾静脉、大隐静脉、面静脉和颈静脉出血 40,41,42。不幸的是，由于动物的大小和细小而脆弱的脉管系统，这些方法对于胚胎血液采集并不理想。斩首后通过重力辅助引流收集血液导致我们的样本采集量低和大量溶血。以前的方案报告了使用改良的 20 G 针头从胸血?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.