신경섬유종증 1형에서 영양 및 신경 발달에 대한 산모의 식단의 효과를 평가하기 위한 태아 쥐 뇌 및 혈청의 동시 수집

요약

이 프로토콜에서는 동일한 마우스 배아에서 태아의 뇌 조직과 고품질의 비용혈 혈청을 동시에 수집하는 방법을 설명합니다. 우리는 이 기술을 활용하여 산모의 식이 노출이 Nf1 (신경섬유종증 1형)에 대한 이형접합 마우스의 다량 영양소 프로필과 태아 신경 발달에 어떤 영향을 미치는지 조사했습니다.

초록

산모의 식단으로 인한 비만은 자손의 신경 발달을 변화시키는 것으로 입증되었으며, 이는 인지 능력 감소, 과잉 행동 및 사회적 행동 장애로 이어질 수 있습니다. 임상적으로 이질적인 유전 질환인 신경섬유종증 1형(NF1)을 앓고 있는 환자도 유사한 결핍을 보일 수 있지만, 산모의 식단과 같은 환경적 요인이 이러한 표현형의 발달에 영향을 미치는지, 영향을 미친다면 그러한 효과가 발생하는 메커니즘은 현재로서는 불분명합니다. 산모의 난생성 식단 노출이 NF1의 신경 발달과 관련된 전신 요인에 어떤 영향을 미치는지 평가할 수 있도록 우리는 대조군 식단과 고지방, 고자당 식단을 먹인 쥐댐의 태아 자손으로부터 비용혈 혈청과 전체 또는 국소적으로 미세 절개된 뇌를 동시에 수집하는 방법을 개발했습니다. 뇌는 냉동 절개 또는 급속 냉동을 위해 처리되어 후속 RNA 또는 단백질 분리에 사용되었습니다. 수집된 조직의 품질은 면역염색을 통해 검증하였다. 혈청의 품질은 다량 영양소 프로필을 분석하여 검증되었습니다. 이 기술을 사용하여 우리는 모계의 난소 형성 식단이 WT와 Nf1-이형접합 새끼 사이에서 유사하게 태아 혈청 콜레스테롤을 증가시킨다는 것을 확인했습니다.

서문

신경섬유종증 1형(NF1)은 생식세포 유전자 돌연변이로 인해 RAS/MAPK(RAt Sarcoma virus/Mitogen-activated Protein Kinase) 신호 전달 경로가 활성화되는 질환 그룹인 RASopathy로 간주됩니다. NF1 RASopathy 환자는 중심 신경계(시신경 경로 신경교종 ^1,2, 고급 신경교종 ^3,4) 및 말초(망상신경섬유종 ^5,6, 악성 말초 신경초 종양 ^7,8) 신경계의 양성 및 악성 종양, 뼈 이형성증⁹ 및 피부 색소 이상¹⁰을 포함한 다양한 증상이 나타날 위험이 있다 (겨드랑이 주근깨, Café-au-Lait Macules). 이 장애가 인지 및 신경 발달에 미치는 영향은 점점 더 많이 인....

프로토콜

이 연구의 모든 동물 시술은 NIH 지침을 따랐으며 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 동물들은 표준 12 시간 빛 : 어두운 사이클링과 음식과 물에 대한 무료 접근으로 수용되었습니다.

1. 산모의 식단

1. 생후 4주에 암컷 쥐를 대조군 차우(CD) 또는 난소 유발 식단(Ob)에 놓습니다.
2. 생후 8-12주가 되면 정확한 수집 연령을 결정하기 위해 이른 아침에 댐의 점액 플러그를 모니터링하여 시간 교미를 설정합니다. 다이어트로 인한 비만을 확인하려면 짝짓기 시 암컷의 체중을 측정합니다.
   참고 : 초기 짝짓기 설정에는 8-12 주 범위가 사용되어 난소 유발 식단을 먹인 암컷이 다른 암컷에 비해 과체중임을 확인했으며, 이는 생후 8 주까지 항상 발생하지 않았습니다. 플러그가 있는 날은 배아 1일(E1)로 간주되며 이 연구에 사용된 모든 동물은 E19에 수집되었습니다. 후기 태아 시점은 이전에 이 시기에 난생 식단에 노출된 동물에서 관찰된 신경 발달 변화로 인해 선택되었습니다(데이터는 표시되지 않음).

토론

생쥐로부터 혈액을 채취하는 전통적인 방법에는 후불, 꼬리 정맥, 복재정맥, 안면 정맥 및 경정맥 출혈이 포함된다 40,41,42. 불행히도, 이러한 방법은 동물의 크기와 작고 섬세한 혈관 구조로 인해 배아 혈액 수집에 이상적이지 않습니다. 참수 후 중력 보조 배액을 통한 혈액 수집은 샘플에서 낮은 수집?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.