Raccolta concomitante di cervello e siero murino fetale per valutare gli effetti della dieta materna sulla nutrizione e sullo sviluppo neurologico nella neurofibromatosi di tipo 1

Riepilogo

In questo protocollo, descriviamo un metodo per la raccolta simultanea di tessuto cerebrale fetale e di siero non emolizzato di alta qualità dallo stesso embrione di topo. Abbiamo utilizzato questa tecnica per indagare come l'esposizione alimentare materna influenzi i profili dei macronutrienti e lo sviluppo neurologico fetale nei topi eterozigoti per Nf1 (Neurofibromatosi di Tipo 1).

Abstract

È stato dimostrato che l'obesità indotta dalla dieta materna altera lo sviluppo neurologico nella prole, il che può portare a una riduzione della capacità cognitiva, iperattività e disturbi del comportamento sociale. I pazienti con la malattia genetica clinicamente eterogenea Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) possono presentare deficit simili, ma al momento non è chiaro se fattori ambientali come la dieta materna influenzino lo sviluppo di questi fenotipi e, in caso affermativo, il meccanismo attraverso il quale tale effetto si verificherebbe. Per consentire la valutazione di come l'esposizione materna alla dieta obesogenica influenzi i fattori sistemici rilevanti per il neurosviluppo nella NF1, abbiamo sviluppato un metodo per raccogliere simultaneamente siero non emolizzato e cervelli interi o micro-sezionati a livello regionale da prole fetale di madri murine alimentate con una dieta di controllo rispetto a una dieta ricca di grassi e saccarosio. I cervelli sono stati processati per la criosezione o congelati per essere utilizzati per il successivo isolamento di RNA o proteine; La qualità del tessuto raccolto è stata verificata mediante immunocolorazione. La qualità del siero è stata verificata analizzando i profili dei macronutrienti. Utilizzando questa tecnica, abbiamo identificato che la dieta obesogenica materna aumenta il colesterolo sierico fetale in modo simile tra i cuccioli eterozigoti WT e Nf1.

Introduzione

La neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è considerata una RASopathy, un gruppo di malattie caratterizzate da mutazioni genetiche germinali che determinano l'attivazione della via di segnalazione RAS/MAPK (RAt Sarcoma virus/Mitogen-activated Protein Kinase). I pazienti con RASopathy NF1 sono a rischio di sviluppare molte manifestazioni diverse, tra cui tumori benigni e maligni del sistema nervoso centrale (glioma ^1,2 della via ottica, glioma di alto grado ^3,4) e periferico (neurofibroma plessiforme ^5,6

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo studio hanno seguito le linee guida NIH e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Washington University di St. Louis. Gli animali sono stati alloggiati con ciclo standard di 12 ore di luce:buio e libero accesso a cibo e acqua.

1. Dieta materna

1. Mettere i topi femmina su cibo di controllo (CD) o dieta obesogenica (Ob) a 4 settimane di età.
2. A 8-12 settimane di età, impostare l'accoppiamento a tempo monitorando il tappo di muco della diga al mattino presto per determinare l'età corrett....

Discussione

I metodi tradizionali per la raccolta del sangue dai topi includono il sanguinamento retrobulbare, della vena caudale, della vena safena, della vena facciale e della vena giugulare 40,41,42. Sfortunatamente, questi metodi non sono ideali per la raccolta del sangue embrionale a causa delle dimensioni dell'animale e della vascolarizzazione piccola e delicata. La raccolta del sangue tramite drenagg.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.