Raccolta concomitante di cervello e siero murino fetale per valutare gli effetti della dieta materna sulla nutrizione e sullo sviluppo neurologico nella neurofibromatosi di tipo 1

Riepilogo

In questo protocollo, descriviamo un metodo per la raccolta simultanea di tessuto cerebrale fetale e di siero non emolizzato di alta qualità dallo stesso embrione di topo. Abbiamo utilizzato questa tecnica per indagare come l'esposizione alimentare materna influenzi i profili dei macronutrienti e lo sviluppo neurologico fetale nei topi eterozigoti per Nf1 (Neurofibromatosi di Tipo 1).

Abstract

È stato dimostrato che l'obesità indotta dalla dieta materna altera lo sviluppo neurologico nella prole, il che può portare a una riduzione della capacità cognitiva, iperattività e disturbi del comportamento sociale. I pazienti con la malattia genetica clinicamente eterogenea Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) possono presentare deficit simili, ma al momento non è chiaro se fattori ambientali come la dieta materna influenzino lo sviluppo di questi fenotipi e, in caso affermativo, il meccanismo attraverso il quale tale effetto si verificherebbe. Per consentire la valutazione di come l'esposizione materna alla dieta obesogenica influenzi i fattori sistemici rilevanti per il neurosviluppo nella NF1, abbiamo sviluppato un metodo per raccogliere simultaneamente siero non emolizzato e cervelli interi o micro-sezionati a livello regionale da prole fetale di madri murine alimentate con una dieta di controllo rispetto a una dieta ricca di grassi e saccarosio. I cervelli sono stati processati per la criosezione o congelati per essere utilizzati per il successivo isolamento di RNA o proteine; La qualità del tessuto raccolto è stata verificata mediante immunocolorazione. La qualità del siero è stata verificata analizzando i profili dei macronutrienti. Utilizzando questa tecnica, abbiamo identificato che la dieta obesogenica materna aumenta il colesterolo sierico fetale in modo simile tra i cuccioli eterozigoti WT e Nf1.

Introduzione

La neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è considerata una RASopathy, un gruppo di malattie caratterizzate da mutazioni genetiche germinali che determinano l'attivazione della via di segnalazione RAS/MAPK (RAt Sarcoma virus/Mitogen-activated Protein Kinase). I pazienti con RASopathy NF1 sono a rischio di sviluppare molte manifestazioni diverse, tra cui tumori benigni e maligni del sistema nervoso centrale (glioma ^1,2 della via ottica, glioma di alto grado ^3,4) e periferico (neurofibroma plessiforme ^5,6, tumore maligno della guaina del nervo periferico ^7,8), nonché displasie ossee⁹ e anomalie pigmentarie della pelle¹⁰ (lentiggini ascellari, macule café-au-lait). L'effetto di questo disturbo sulla cognizione e sullo sviluppo neurologico è sempre più riconosciuto, con i pazienti con NF1 che mostrano una maggiore incidenza di deficit di apprendimento, iperattività e disturbo dello spettro autistico 11,12,13. Tuttavia, esiste una significativa eterogeneità nello sviluppo di questi fenotipi tra i pazienti 13,14,15,16,17 e non è chiaro il motivo per cui alcuni pazienti mostrano significativi disturbi cognitivi mentre altri non ne sono affetti. È stato dimostrato che l'obesità indotta dalla dieta materna influisce in modo simile sull'apprendimento e sul comportamento nella popolazione generale 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, suggerendo che le esposizioni alimentari materne differenziali alla NF1 potrebbero essere una fonte di questa eterogeneità clinica. In particolare, i figli di madri obese mostrano un aumentato rischio di sviluppare iperattività 18,19,20,23,25,26, autismo 19,24,27, deficit della funzione esecutiva ^21,23 e hanno punteggi QI su scala completa più bassi^22,28. Tuttavia, i pazienti con NF1 hanno fenotipi metabolici alterati rispetto alla popolazione generale, tra cui una ridotta incidenza di obesità e diabete 29,30,31, rendendo poco chiaro se risponderebbero in modo simile agli stimoli dietetici.

Per rispondere a queste domande, abbiamo voluto determinare se i cambiamenti indotti dalla dieta obesogenica al profilo dei macronutrienti nella prole fetale con Nf1 hanno contribuito ai cambiamenti dello sviluppo neurologico. In precedenza abbiamo raccolto dal cervello fetale tessuti interi e micro-sezionati a livello regionale di alta qualità appropriati per applicazioni di sviluppo neurologico³². Tuttavia, la raccolta del sangue fetale è impegnativa a causa delle piccole dimensioni del corpo e del basso volume di sangue³³. La raccolta del sangue tramite drenaggio per gravità dopo la decapitazione ha portato a bassi volumi di raccolta e a una significativa emolisi nei nostri campioni, che possono influenzare l'interpretazione dell'applicazione a valle. La raccolta tramite aspirazione dal cuore fetale o dai vasi toracici, come è stato precedentemente riportato³³, era tecnicamente impegnativa e provocava anche frequenti emolisi. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per la raccolta del siero fetale, che utilizza tubi capillari specializzati per consentire una raccolta di volume più elevato senza uno sforzo di taglio significativo.

Qui, presentiamo questo metodo per raccogliere simultaneamente cervelli embrionali e siero fetale da cuccioli eterozigoti Nf1 esposti a una dieta ricca di grassi e zuccheri rispetto a una dieta di controllo in utero (Figura 1 e Tabella supplementare S1). I cervelli sono stati crio-incorporati per la successiva analisi mediante immunofluorescenza o micro-sezionati a livello regionale e congelati per il successivo utilizzo in applicazioni di biologia molecolare. È stato ottenuto un siero di alta qualità, adatto per applicazioni a valle come la profilazione dei macronutrienti. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato che l'esposizione alimentare materna ad alto contenuto di grassi e saccarosio porta all'aumento dei livelli sierici di colesterolo sia nei cuccioli eterozigoti WT che in quelli Nf1.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo studio hanno seguito le linee guida NIH e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Washington University di St. Louis. Gli animali sono stati alloggiati con ciclo standard di 12 ore di luce:buio e libero accesso a cibo e acqua.

1. Dieta materna

1. Mettere i topi femmina su cibo di controllo (CD) o dieta obesogenica (Ob) a 4 settimane di età.
2. A 8-12 settimane di età, impostare l'accoppiamento a tempo monitorando il tappo di muco della diga al mattino presto per determinare l'età corretta per la raccolta. Per verificare l'obesità indotta dalla dieta, pesare le femmine al momento dell'accoppiamento.
   NOTA: Per la configurazione iniziale dell'accoppiamento è stato utilizzato un intervallo di 8-12 settimane per garantire che le femmine alimentate con dieta obesogenica fossero in sovrappeso rispetto alle loro controparti, cosa che non sempre si verificava entro le 8 settimane di età. Il giorno del plug è considerato embrionale giorno 1 (E1) e tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati raccolti a E19. Il punto temporale fetale tardivo è stato scelto a causa dei cambiamenti dello sviluppo neurologico precedentemente osservati in questo periodo negli animali esposti alla dieta obesogenica (dati non mostrati).

2. Rimozione del feto dalla diga

1. Innanzitutto, assicurati che la madre appaia gravida (forma e pienezza addominale, palpazione addominale o movimento fetale). In caso di dubbio, pesare nuovamente la femmina per misurare l'aumento di peso.
   NOTA: Le tope gravide tardive dovrebbero mostrare almeno 3-4 g di aumento di peso. Per aumentare la probabilità di concepimento nel periodo di tempo desiderato, la segatura sporca (contenente urina e feromoni) dalla gabbia di un maschio può essere aggiunta alla gabbia della femmina ogni giorno per 3 giorni prima dell'accoppiamento per indurre l'estro³⁴.
2. Sopprimere la madre mettendola in una camera con un tovagliolo di carta contenente 3 ml di isoflurano, facendo attenzione a evitare il contatto diretto tra la madre e il tovagliolo di carta imbevuto di anestesia. Dopo che l'animale è stato sedato, posizionalo su un tovagliolo di carta, tienilo per la coda, posiziona le forbici da dissezione sul collo e poi forza le forbici verso l'alto verso la testa per eseguire la lussazione cervicale. In alternativa, eseguire la decapitazione dopo la sedazione con isoflurano.
   NOTA: Il siero può essere raccolto dalla madre in questa fase, utilizzando una metodologia simile a quella descritta di seguito, ma con tubi capillari più grandi. Se lo si desidera, deve essere eseguita la decapitazione piuttosto che la lussazione cervicale. Si deve fare attenzione per garantire che il fenotipo di interesse non venga alterato dalla somministrazione di isoflurano immediatamente prima dell'eutanasia.
3. Posizionare la diga con il lato ventrale rivolto verso l'alto in un piatto da 100 mm. Pizzica la pelle che copre l'addome e fai un'incisione sulla linea mediana con le forbici da dissezione. Praticare ulteriori incisioni perpendicolari all'incisione della linea mediana per creare lembi di pelle per esporre l'utero contenente gli embrioni.
4. Estrarre l'utero dalla cavità addominale. Usando le forbici, scollegare l'utero dalla diga. Metti la sacca embrionale intatta ("perle su un filo") contenente gli embrioni in un piatto con soluzione salina fredda sterile 1x tamponata con fosfato (PBS). Metti il piatto di feti sul ghiaccio.
   NOTA: Poiché ogni cucciolata contiene in genere 6-10 cuccioli che verranno raccolti sia per il cervello che per il siero, i feti vengono tenuti sul ghiaccio per evitare la degradazione dei tessuti. Mettere i cuccioli sul ghiaccio garantisce inoltre un'adeguata eutanasia dei cuccioli, poiché l'eutanasia materna da sola potrebbe non essere sempre sufficiente. Se si desidera solo la raccolta del siero, può essere preferibile la raccolta a temperatura ambiente.

3. Raccolta del siero fetale

1. Rimuovere il feto dal sacco embrionale sezionandolo accuratamente con una pinza #5. Trasferire l'embrione in un piatto utilizzando una pinza curva con 1x PBS sterile freddo fresco.
2. Tamponare delicatamente l'animale su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido amniotico residuo e il PBS dal campione.
3. Tieni l'animale per l'addome. Decapitare parzialmente l'animale con micro forbici praticando un'incisione sul collo ventrale. Assicurati che i vasi sanguigni siano tagliati, ma che la pelle che tiene la testa sia ancora attaccata.
   NOTA: La testa deve rimanere attaccata in modo che il sangue possa essere raccolto contemporaneamente dal corpo e dalla testa.
4. Tenere il corpo a un angolo di 45° con l'incisione rivolta verso il basso. Tenere la minivetta da 50 μl (tubo capillare) parallela al sito di incisione della diga dove il sangue forma una gocciolina. Lasciare che la provetta capillare da 50 μl si riempia di sangue.
   NOTA: La provetta capillare x2 o la provetta capillare da 100 μL possono essere utilizzate per raccogliere fino a ~75 μL di sangue.
5. Posizionare la testa in un piatto fresco da 60 mm contenente 1x PBS freddo e sterile per un'ulteriore raccolta dei tessuti (sezione 4).
6. Dopo che il sangue è all'interno del tubo capillare, premere rapidamente lo stantuffo in un tubo da 1,5 mL. Muovi il tubo o giralo rapidamente per assicurarti che il sangue sia sul fondo del tubo.
7. Ripetere per il resto della cucciolata.
   NOTA: Tenere i cuccioli sul ghiaccio e muoversi rapidamente tra loro è essenziale per ridurre il rischio di coagulazione post mortem che limiterà il volume di raccolta.
8. Coagulare il sangue a temperatura ambiente per 30 minuti.
9. Centrifugare i campioni di sangue a 4 °C, 16.000 × g per 20 minuti.
10. Trasferire il siero in provette fresche da 500 μl con una pipetta da 200 μl, senza disturbare il pellet di cellule del sangue sul fondo della provetta.
    NOTA: Il siero deve essere di colore paglierino senza detriti rossi. Ogni feto dovrebbe produrre 15-30 μL di siero.
11. Conservare il siero raccolto a -80 °C.

4. Raccolta del cervello fetale

1. Guardando attraverso il microscopio da dissezione, tieni il muso usando una pinza curva e usa la pinza #5 per staccare con cura la pelle dalla calotta cranica, tenendola attaccata al muso per facilitarne la presa. Angolo #5 pinza a 45° rispetto al cranio, perforare con cura la membrana trasparente che è il cranio in via di sviluppo, spostare la pinza parallelamente al cranio, inserirla sotto la calotta cranica, quindi pizzicare e staccare da un lato. Dopo aver rimosso un lato, afferrare il lato rimanente con una pinza #5 e staccare dall'altro lato.
2. Raccogli delicatamente il cervello dal cranio usando un micro cucchiaio e trasferisci il cervello in un piatto fresco da 60 mm contenente 1x PBS freddo.
   NOTA: A questo punto, l'intero cervello può essere fissato e incorporato per l'immunocolorazione. Cfr. la metodologia³² pubblicata in precedenza.
3. Se il tessuto deve essere congelato a scatto per altre applicazioni molecolari, sezionare l'area di interesse. L'isolamento del tessuto periventricolare intorno al ventricolo laterale, terzo e quarto è descritto di seguito.
   1. Usando la pinza curva, tieni il cervello all'incrocio tra il rombencefalo e il proencefalo con la mano non dominante. Con la mano dominante, tieni il bisturi con la lama parallela alla superficie del cervello. Premere con decisione nella regione corticale media (Figura 1).
   2. Tenendo ancora il rombencefalo, fai una seconda incisione davanti al rombencefalo per separarlo dal proencefalo (Figura 1). Nella sezione più anteriore, cerca due piccoli spazi semicircolari situati all'interno del piano orizzontale, che sono i ventricoli laterali. Utilizzare le pinze curve posizionate al centro di ciascun ventricolo per tenere il cervello in posizione, sezionare accuratamente il rivestimento utilizzando una pinza #5 e rimuoverle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml fresca e pulita.
   3. Nella sezione centrale, cerca un piccolo spazio lineare sulla superficie ventrale, che è il terzo ventricolo. Utilizzando una pinza #5, pizzicare con cura il rivestimento su entrambi i lati della superficie ventricolare, quindi rimuoverlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml fresca e pulita.
   4. Nella sezione più posteriore, cerca un piccolo spazio lineare centrale all'interno del rombencefalo, che è il quarto ventricolo. Sezionare il rivestimento su entrambi i lati utilizzando una pinza #5, quindi rimuoverlo in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml fresca e pulita.
      NOTA: Se l'affettatura del rombencefalo non è un taglio netto, il tessuto del quarto ventricolo può essere oscurato e/o distrutto.
   5. Per i passaggi 4.3.2-4.3.4, subito dopo che il tessuto è stato inserito nelle provette per microcentrifuga, posizionare rapidamente le provette in un contenitore criosicuro contenente azoto liquido.
      NOTA: Le provette possono essere conservate in azoto liquido fino a quando i campioni rimanenti non sono stati sezionati. ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare gravi congelamenti. Non infilare le mani direttamente nell'azoto liquido ed evitare schizzi.
   6. Posizionare le provette congelate sul ghiaccio secco e trasferire i fazzoletti congelati in un congelatore a -80 °C fino al momento dell'uso.

Risultati

Per illustrare la qualità del tessuto cerebrale ottenuto con questa tecnica, mostriamo campioni di cervelli fetali da topi Nestin-CFPnuc³⁵, immunocolorati per GFAP secondo una tecnica precedentemente riportata³². Le cellule Nestin⁺ sono visibili rivestire il ventricolo laterale (Figura 2A), con filamenti GFAP⁺ che si estendono dalla superficie. Non abbiamo osservato differenze tra l'espre...

Discussione

I metodi tradizionali per la raccolta del sangue dai topi includono il sanguinamento retrobulbare, della vena caudale, della vena safena, della vena facciale e della vena giugulare 40,41,42. Sfortunatamente, questi metodi non sono ideali per la raccolta del sangue embrionale a causa delle dimensioni dell'animale e della vascolarizzazione piccola e delicata. La raccolta del sangue tramite drenagg...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.