Coleta Simultânea de Cérebro Murino Fetal e Soro para Avaliar os Efeitos da Dieta Materna na Nutrição e Neurodesenvolvimento na Neurofibromatose Tipo 1

Resumo

Neste protocolo, descrevemos um método para coleta simultânea de tecido cerebral fetal, bem como soro não hemolisado de alta qualidade do mesmo embrião de camundongo. Utilizamos essa técnica para interrogar como a exposição dietética materna afeta os perfis de macronutrientes e o neurodesenvolvimento fetal em camundongos heterozigotos para Nf1 (Neurofibromatose Tipo 1).

Resumo

Foi demonstrado que a obesidade induzida pela dieta materna altera o neurodesenvolvimento na prole, o que pode levar à redução da capacidade cognitiva, hiperatividade e prejuízos no comportamento social. Pacientes com o distúrbio genético clinicamente heterogêneo Neurofibromatose Tipo 1 (NF1) podem apresentar déficits semelhantes, mas atualmente não está claro se fatores ambientais, como dieta materna, influenciam o desenvolvimento desses fenótipos e, em caso afirmativo, o mecanismo pelo qual tal efeito ocorreria. Para permitir a avaliação de como a exposição à dieta obesogênica materna afeta os fatores sistêmicos relevantes para o neurodesenvolvimento na NF1, desenvolvemos um método para coletar simultaneamente soro não hemolisado e cérebros inteiros ou microdissecados regionalmente de descendentes fetais de mães murinas alimentadas com uma dieta controle versus uma dieta rica em gordura e sacarose. Os cérebros foram processados para criosseccionamento ou congelados rapidamente para uso em subsequente isolamento de RNA ou proteína; A qualidade do tecido coletado foi verificada por imunomarcação. A qualidade do soro foi verificada por meio da análise do perfil de macronutrientes. Usando esta técnica, identificamos que a dieta obesogênica materna aumenta o colesterol sérico fetal de forma semelhante entre filhotes heterozigotos WT e Nf1.

Introdução

A neurofibromatose tipo 1 (NF1) é considerada uma RASopatia, um grupo de distúrbios caracterizados por mutações genéticas germinativas que resultam na ativação da via de sinalização RAS/MAPK (vírus do sarcoma RAt/proteína quinase ativada por mitógeno). Pacientes com a AF1 RASopatia correm o risco de desenvolver muitas manifestações diferentes, incluindo tumores benignos e malignos do sistema nervoso central (glioma da via óptica ^1,2, glioma de alto grau ^3,4) e periférico (neurofibroma plexiforme ^5,6

Protocolo

Todos os procedimentos em animais neste estudo seguiram as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington em St. Louis. Os animais foram alojados com ciclagem padrão de 12 h claro:escuro e livre acesso a comida e água.

1. Dieta materna

1. Coloque os camundongos fêmeas em ração de controle (CD) ou dieta obesogênica (Ob) às 4 semanas de idade.
2. Com 8-12 semanas de idade, estabeleça o acasalamento cronometrado monitorando o tampão mucoso da barragem no início da manhã para determinar a idade correta de co....

Discussão

Os métodos tradicionais de coleta de sangue de camundongos incluem sangramento retrobulbar, da veia da cauda, da veia safena, da veia facial e da veia jugular 40,41,42. Infelizmente, esses métodos não são ideais para coleta de sangue embrionário devido ao tamanho do animal e à vasculatura pequena e delicada. A coleta de sangue por drenagem auxiliada por gravidade após a decapitação levo.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.