Coleta Simultânea de Cérebro Murino Fetal e Soro para Avaliar os Efeitos da Dieta Materna na Nutrição e Neurodesenvolvimento na Neurofibromatose Tipo 1

Resumo

Neste protocolo, descrevemos um método para coleta simultânea de tecido cerebral fetal, bem como soro não hemolisado de alta qualidade do mesmo embrião de camundongo. Utilizamos essa técnica para interrogar como a exposição dietética materna afeta os perfis de macronutrientes e o neurodesenvolvimento fetal em camundongos heterozigotos para Nf1 (Neurofibromatose Tipo 1).

Resumo

Foi demonstrado que a obesidade induzida pela dieta materna altera o neurodesenvolvimento na prole, o que pode levar à redução da capacidade cognitiva, hiperatividade e prejuízos no comportamento social. Pacientes com o distúrbio genético clinicamente heterogêneo Neurofibromatose Tipo 1 (NF1) podem apresentar déficits semelhantes, mas atualmente não está claro se fatores ambientais, como dieta materna, influenciam o desenvolvimento desses fenótipos e, em caso afirmativo, o mecanismo pelo qual tal efeito ocorreria. Para permitir a avaliação de como a exposição à dieta obesogênica materna afeta os fatores sistêmicos relevantes para o neurodesenvolvimento na NF1, desenvolvemos um método para coletar simultaneamente soro não hemolisado e cérebros inteiros ou microdissecados regionalmente de descendentes fetais de mães murinas alimentadas com uma dieta controle versus uma dieta rica em gordura e sacarose. Os cérebros foram processados para criosseccionamento ou congelados rapidamente para uso em subsequente isolamento de RNA ou proteína; A qualidade do tecido coletado foi verificada por imunomarcação. A qualidade do soro foi verificada por meio da análise do perfil de macronutrientes. Usando esta técnica, identificamos que a dieta obesogênica materna aumenta o colesterol sérico fetal de forma semelhante entre filhotes heterozigotos WT e Nf1.

Introdução

A neurofibromatose tipo 1 (NF1) é considerada uma RASopatia, um grupo de distúrbios caracterizados por mutações genéticas germinativas que resultam na ativação da via de sinalização RAS/MAPK (vírus do sarcoma RAt/proteína quinase ativada por mitógeno). Pacientes com a AF1 RASopatia correm o risco de desenvolver muitas manifestações diferentes, incluindo tumores benignos e malignos do sistema nervoso central (glioma da via óptica ^1,2, glioma de alto grau ^3,4) e periférico (neurofibroma plexiforme ^5,6, tumor maligno da bainha do nervo periférico ^7,8), bem como displasias ósseas⁹ e anormalidades pigmentares da pele¹⁰ (sardas axilares, máculas café-com-leite). O efeito desse distúrbio na cognição e no neurodesenvolvimento está sendo cada vez mais reconhecido, com pacientes com NF1 apresentando uma incidência aumentada de déficits de aprendizagem, hiperatividade e transtorno do espectro do autismo 11,12,13. No entanto, há uma heterogeneidade significativa no desenvolvimento desses fenótipos entre os pacientes 13,14,15,16,17, e não está claro por que alguns pacientes apresentam deficiências cognitivas significativas enquanto outros não são afetados. A obesidade induzida pela dieta materna demonstrou afetar de forma semelhante o aprendizado e o comportamento na população em geral 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 , sugerindo que as exposições dietéticas maternas diferenciais na NF1 podem ser uma fonte dessa heterogeneidade clínica. Em particular, filhos de mães obesas apresentam um risco aumentado de desenvolver hiperatividade 18,19,20,23,25,26, autismo 19,24,27, déficits de funções executivas^21,23 e têm escores de QI mais baixos em escala total^22,28. No entanto, os pacientes com NF1 apresentam fenótipos metabólicos alterados em comparação com a população em geral, incluindo diminuição da incidência de obesidade e diabetes 29,30,31, não ficando claro se eles responderiam de forma semelhante aos estímulos dietéticos.

Para abordar essas questões, desejamos determinar se as mudanças induzidas pela dieta obesogênica no perfil de macronutrientes na prole fetal com Nf1 contribuíram para as mudanças no neurodesenvolvimento. Anteriormente, coletamos tecido inteiro e microdissecado regionalmente de alta qualidade apropriado para aplicações de neurodesenvolvimento do cérebro fetal³². No entanto, a coleta de sangue fetal é desafiadora devido ao pequeno tamanho corporal e baixo volume sanguíneo³³. A coleta de sangue por meio de drenagem auxiliada por gravidade após a decapitação levou a baixos volumes de coleta e hemólise significativa em nossas amostras, o que pode afetar a interpretação da aplicação a jusante. A coleta por aspiração do coração fetal ou dos vasos torácicos, como relatado anteriormente³³, foi tecnicamente desafiadora e também resultou em hemólise frequente. Assim, desenvolvemos um método para coleta de soro fetal, que utiliza tubos capilares especializados para permitir uma coleta de maior volume sem estresse de cisalhamento significativo.

Aqui, apresentamos este método para coletar simultaneamente cérebros embrionários e soro fetal de filhotes heterozigotos Nf1 expostos a uma dieta rica em gordura e açúcar versus uma dieta controle no útero (Figura 1 e Tabela Suplementar S1). Os cérebros foram crioincorporados para análise subsequente por imunofluorescência ou microdissecados regionalmente e congelados para uso subsequente em aplicações de biologia molecular. Foi obtido soro de alta qualidade, adequado para aplicações a jusante, como perfil de macronutrientes. Utilizando este método, identificamos que a exposição dietética materna com alto teor de gordura e sacarose leva à elevação dos níveis séricos de colesterol em filhotes heterozigotos WT e Nf1.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais neste estudo seguiram as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington em St. Louis. Os animais foram alojados com ciclagem padrão de 12 h claro:escuro e livre acesso a comida e água.

1. Dieta materna

1. Coloque os camundongos fêmeas em ração de controle (CD) ou dieta obesogênica (Ob) às 4 semanas de idade.
2. Com 8-12 semanas de idade, estabeleça o acasalamento cronometrado monitorando o tampão mucoso da barragem no início da manhã para determinar a idade correta de coleta. Para verificar a obesidade induzida por dieta, pesar as fêmeas no acasalamento.
   NOTA: Um intervalo de 8 a 12 semanas foi usado para a configuração inicial do acasalamento para garantir que as fêmeas obesogênicas alimentadas com dieta estivessem acima do peso em comparação com suas contrapartes, o que nem sempre ocorria às 8 semanas de idade. O dia do plug é considerado dia embrionário 1 (E1), e todos os animais utilizados neste estudo foram coletados em E19. O ponto de tempo fetal tardio foi escolhido devido a alterações no neurodesenvolvimento observadas anteriormente neste momento em animais obesogênicos expostos à dieta (dados não mostrados).

2. Remoção do feto da barragem

1. Primeiro, certifique-se de que a mãe pareça grávida (forma e plenitude abdominal, palpação abdominal ou movimento fetal). Em caso de dúvida, pese a fêmea novamente para medir o ganho de peso.
   NOTA: Camundongos prenhes tardios devem apresentar pelo menos 3-4 g de ganho de peso. Para aumentar a probabilidade de concepção no período de tempo desejado, a serragem suja (contendo urina e feromônio) da gaiola de um macho pode ser adicionada à gaiola da fêmea diariamente por 3 dias antes do acasalamento para induzir o estro³⁴.
2. Eutanasiar a barragem colocando-a em uma câmara com papel toalha contendo 3 mL de isoflurano, tomando cuidado para evitar o contato direto entre a barragem e a toalha de papel embebida em anestésico. Depois que o animal estiver sedado, coloque-o sobre uma toalha de papel, segure-o pela cauda, coloque uma tesoura de dissecção no pescoço e, em seguida, force a tesoura para cima em direção à cabeça para realizar a luxação cervical. Como alternativa, realize a decapitação após a sedação com isoflurano.
   NOTA: O soro pode ser coletado da barragem nesta etapa, usando uma metodologia semelhante à descrita abaixo, mas com tubos capilares maiores. Se isso for desejado, deve-se realizar decapitação em vez de luxação cervical. Deve-se tomar cuidado para garantir que o fenótipo de interesse não seja alterado pela administração de isoflurano imediatamente antes da eutanásia.
3. Colocar o lado ventral da barragem para cima num prato de 100 mm. Aperte a pele que cobre o abdômen e faça uma incisão na linha média com uma tesoura de dissecação. Faça incisões adicionais perpendiculares à incisão da linha média para criar retalhos de pele para expor o útero que contém os embriões.
4. Puxe o útero para fora da cavidade abdominal. Usando uma tesoura, desconecte o útero da barragem. Coloque o saco embrionário intacto ("pérolas em um barbante") contendo os embriões em um prato com solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) estéril e fria. Coloque o prato de fetos no gelo.
   NOTA: Como cada ninhada normalmente contém de 6 a 10 filhotes que serão colhidos para o cérebro e o soro, os fetos são mantidos no gelo para evitar a degradação do tecido. Colocar os filhotes no gelo também garante a eutanásia adequada dos filhotes, pois a eutanásia materna por si só nem sempre é suficiente. Se apenas a coleta de soro for desejada, a coleta em temperatura ambiente pode ser preferida.

3. Coleta de soro fetal

1. Remova o feto do saco embrionário dissecando cuidadosamente com uma pinça # 5. Transfira o embrião para um prato usando uma pinça curva com 1x PBS fresco e frio estéril.
2. Seque suavemente o animal em uma toalha de papel para remover o líquido amniótico residual e o PBS da amostra.
3. Segure o animal pelo abdômen. Decapite parcialmente o animal com uma micro tesoura, fazendo uma incisão no pescoço ventral. Certifique-se de que os vasos sanguíneos estejam cortados, mas a pele que mantém a cabeça ainda esteja presa.
   NOTA: A cabeça deve permanecer presa para que o sangue possa ser coletado do corpo e da cabeça simultaneamente.
4. Segure o corpo em um ângulo de 45° com a incisão voltada para baixo. Segure a minivette de 50 μL (tubo capilar) paralela ao local da incisão da barragem, onde o sangue forma uma gotícula. Deixe cuidadosamente o tubo capilar de 50 μL se encher de sangue.
   NOTA: Tubo capilar x2 ou tubo capilar de 100 μL pode ser usado para coletar até ~75 μL de sangue.
5. Coloque a cabeça em um prato fresco de 60 mm contendo PBS 1x frio e estéril para posterior coleta de tecido (seção 4).
6. Depois que o sangue estiver dentro do tubo capilar, pressione o êmbolo rapidamente em um tubo de 1,5 mL. Sacuda o tubo ou gire-o rapidamente para se certificar de que o sangue está no fundo do tubo.
7. Repita para o restante da ninhada.
   NOTA: Manter os filhotes no gelo e mover-se rapidamente entre eles é essencial para reduzir o risco de coagulação post-mortem que limitará o volume de coleta.
8. Coagular o sangue à temperatura ambiente durante 30 min.
9. Centrifugar as amostras de sangue a 4 °C, 16.000 × g durante 20 min.
10. Transfira o soro para tubos novos de 500 μL com uma pipeta de 200 μL, sem perturbar o sedimento de células sanguíneas no fundo do tubo.
    NOTA: O soro deve ser cor de palha, sem detritos vermelhos. Cada feto deve produzir 15-30 μL de soro.
11. Conservar o soro recolhido a -80 °C.

4. Coleta de cérebro fetal

1. Olhando através do microscópio de dissecação, segure o focinho usando uma pinça curva e use uma pinça # 5 para retirar cuidadosamente a pele da calota craniana, mantendo-a presa no focinho para facilitar a sustentação. Incline a pinça # 5 a 45 ° em relação ao crânio, perfure cuidadosamente a membrana transparente que é o crânio em desenvolvimento, desloque a pinça paralelamente ao crânio, insira-a embaixo da calota craniana e, em seguida, aperte e descasque para um lado. Depois que um lado for removido, segure o lado restante com uma pinça # 5 e descasque para o outro lado.
2. Retire delicadamente o cérebro do crânio usando uma micro colher e transfira o cérebro para um prato fresco de 60 mm contendo 1x PBS frio.
   NOTA: Neste ponto, cérebros inteiros podem ser fixados e incorporados para imunocoloração. Ver metodologia publicada anteriormente³².
3. Se o tecido precisar ser congelado para outras aplicações moleculares, subdisseque a área de interesse. O isolamento do tecido periventricular ao redor do lateral, terceiro e quarto ventrículos é descrito a seguir.
   1. Usando a pinça curva, segure o cérebro na junção do rombencéfalo e do prosencéfalo com a mão não dominante. Com a mão dominante, segure o bisturi com a lâmina paralela à superfície do cérebro. Pressione firmemente a região cortical média (Figura 1).
   2. Ainda segurando o rombencéfalo, faça uma segunda incisão na frente do rombencéfalo para separá-lo do prosencéfalo (Figura 1). Na seção mais anterior, procure dois pequenos espaços semicirculares localizados no plano horizontal, que são os ventrículos laterais. Use a pinça curva colocada no centro de cada ventrículo para manter o cérebro no lugar, disseque cuidadosamente o revestimento usando uma pinça # 5 e remova para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpo e fresco.
   3. Na seção do meio, procure um pequeno espaço linear na superfície ventral, que é o terceiro ventrículo. Usando uma pinça # 5, aperte cuidadosamente o revestimento em ambos os lados da superfície ventricular e, em seguida, remova-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpo e fresco.
   4. Na seção mais posterior, procure um pequeno espaço linear central dentro do rombencéfalo, que é o quarto ventrículo. Disseque o revestimento em ambos os lados usando uma pinça # 5 e, em seguida, remova para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL.
      NOTA: Se cortar o rombencéfalo não for um corte limpo, o tecido do quarto ventrículo pode ser obscurecido e / ou destruído.
   5. Para as etapas 4.3.2-4.3.4, imediatamente após o tecido ter sido colocado em tubos de microcentrífuga, coloque os tubos rapidamente em um recipiente criogênico contendo nitrogênio líquido.
      NOTA: Os tubos podem ser mantidos em nitrogênio líquido até que as amostras restantes tenham sido dissecadas. CUIDADO: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras graves. Não cole as mãos diretamente no nitrogênio líquido e evite respingos.
   6. Coloque o(s) tubo(s) congelado(s) em gelo seco e transfira o tecido congelado para um freezer a -80 °C até o uso.

Resultados

Para ilustrar a qualidade do tecido cerebral obtido por meio dessa técnica, mostramos amostras de cérebros fetais de camundongos Nestin-CFPnuc³⁵, imunomarcados para GFAP por uma técnica relatada anteriormente³². As células Nestin⁺ são vistas revestindo o ventrículo lateral (Figura 2A), com filamentos GFAP⁺ estendendo-se da superfície. Não observamos diferenças entre a expressão d...

Discussão

Os métodos tradicionais de coleta de sangue de camundongos incluem sangramento retrobulbar, da veia da cauda, da veia safena, da veia facial e da veia jugular 40,41,42. Infelizmente, esses métodos não são ideais para coleta de sangue embrionário devido ao tamanho do animal e à vasculatura pequena e delicada. A coleta de sangue por drenagem auxiliada por gravidade após a decapitação levo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.