神経線維腫症1型における母親の食事療法が栄養と神経発達に及ぼす影響を評価するための胎児マウス脳と血清の同時収集

要約

このプロトコルでは、胎児の脳組織と、同じマウス胚からの高品質の非溶血血清を同時に収集する方法について説明します。この手法を利用して、母親の食事への曝露が 、Nf1 (神経線維腫症 1 型) のヘテロ接合型マウスの主要栄養素プロファイルと胎児の神経発達にどのように影響するかを調査しました。

要約

母親の食事誘発性肥満は、子孫の神経発達を変化させることが実証されており、認知能力の低下、多動性、および社会的行動の障害につながる可能性があります。臨床的に不均一な遺伝性疾患である神経線維腫症1型(NF1)の患者は、同様の欠損を呈する可能性がありますが、母親の食事などの環境要因がこれらの表現型の発達に影響を与えるかどうか、もしそうなら、そのような影響が発生するメカニズムは現在のところ不明です。母親の肥満食への曝露がNF1の神経発達に関連する全身因子にどのように影響するかを評価できるようにするために、対照食と高脂肪、高ショ糖食を与えられたマウスダムの胎児の子孫から、非溶血血清と全体または局所的に微視された脳を同時に収集する方法を開発しました。脳は凍結切片処理のために処理されたか、またはその後のRNAまたはタンパク質の単離に使用するために瞬間凍結されました。採取した組織の品質を免疫染色により確認しました。血清の品質は、主要栄養素プロファイルを分析することにより確認しました。この手法を用いて、母体の肥満食は、WTと Nf1-ヘテロ接合性の子犬の間で胎児の血清コレステロールを同様に増加させることを同定した。

概要

神経線維腫症 1 型 (NF1) は、RAS/MAPK (RAt 肉腫ウイルス/マイトジェン活性化プロテイン キナーゼ) シグナル伝達経路の活性化をもたらす生殖細胞系遺伝子変異を特徴とする障害群である RASopathy と考えられています。NF1 RASopathyの患者は、中枢性腫瘍(視神経膠腫^1,2、高悪性度神経膠腫^3,4)および末梢性腫瘍(フジツボ神経線維腫^5,6、悪性度末梢神経鞘腫瘍^7,8)の良性腫瘍と悪性腫瘍の両方、ならびに骨異^{形成9および}皮膚色素異常¹⁰を含む、多くの異なる症状を発症するリスクがあります(腋窩そばかす、カフェオレ斑)。この障害が認知と神経発達に及ぼす影響はますます認識されており、NF1患者は学習障害、多動性、および自閉症スペクトラム障害の発生率の増加を示しています11,12,1....

プロトコル

この研究のすべての動物手順はNIHのガイドラインに従い、セントルイスのワシントン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。動物は、標準的な12時間のライト:ダークサイクリングと、食べ物と水への無料アクセスで収容されました。

1.母性ダイエット

1. 雌マウスを4週齢でコントロールチャウ(CD)または肥満食(Ob)に置きます。
2. 8〜12週齢で、早朝にダムの粘液栓を監視して時限交配を設定し、正しい収集年齢を決定します。食事誘発性肥満を確認するには、交配時に雌の体重を量ります。
   注:肥満食を与えられた女性が、8週齢までに常に発生したとは限らない、対応する女性と比較して太りすぎであることを確認するために、最初の交配セットアップに8〜12週間の範囲が使用されました。プラグの日は胚の1日目(E1)と考えられており、この研究で使用されたすべての動物はE19で収集されました。胎児後期の時点は、この時期に肥満食に曝露された動物で以前に観察された神経発達の変化のために選択されました(データは示されていません)。

2.ダムからの胎児の除去

1. まず、母が妊娠しているように見えることを確認します(腹部の形と膨満感、腹部の触診、ま....

ディスカッション

マウスから血液を採取する従来の方法には、球後静脈、尾静脈、伏在静脈、顔面静脈、および頸静脈出血40,41,42が含まれる。残念ながら、これらの方法は、動物のサイズと小さくて繊細な血管系のために、胚の採血には理想的ではありません。斬首後の重力を利用したドレナージによる採血は、サ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.