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要約

このプロトコルでは、胎児の脳組織と、同じマウス胚からの高品質の非溶血血清を同時に収集する方法について説明します。この手法を利用して、母親の食事への曝露が 、Nf1 (神経線維腫症 1 型) のヘテロ接合型マウスの主要栄養素プロファイルと胎児の神経発達にどのように影響するかを調査しました。

要約

母親の食事誘発性肥満は、子孫の神経発達を変化させることが実証されており、認知能力の低下、多動性、および社会的行動の障害につながる可能性があります。臨床的に不均一な遺伝性疾患である神経線維腫症1型(NF1)の患者は、同様の欠損を呈する可能性がありますが、母親の食事などの環境要因がこれらの表現型の発達に影響を与えるかどうか、もしそうなら、そのような影響が発生するメカニズムは現在のところ不明です。母親の肥満食への曝露がNF1の神経発達に関連する全身因子にどのように影響するかを評価できるようにするために、対照食と高脂肪、高ショ糖食を与えられたマウスダムの胎児の子孫から、非溶血血清と全体または局所的に微視された脳を同時に収集する方法を開発しました。脳は凍結切片処理のために処理されたか、またはその後のRNAまたはタンパク質の単離に使用するために瞬間凍結されました。採取した組織の品質を免疫染色により確認しました。血清の品質は、主要栄養素プロファイルを分析することにより確認しました。この手法を用いて、母体の肥満食は、WTと Nf1-ヘテロ接合性の子犬の間で胎児の血清コレステロールを同様に増加させることを同定した。

概要

神経線維腫症 1 型 (NF1) は、RAS/MAPK (RAt 肉腫ウイルス/マイトジェン活性化プロテイン キナーゼ) シグナル伝達経路の活性化をもたらす生殖細胞系遺伝子変異を特徴とする障害群である RASopathy と考えられています。NF1 RASopathyの患者は、中枢性腫瘍(視神経膠腫1,2、高悪性度神経膠腫3,4)および末梢性腫瘍(フジツボ神経線維腫5,6、悪性度末梢神経鞘腫瘍7,8)の良性腫瘍と悪性腫瘍の両方、ならびに骨異形成9および皮膚色素異常10を含む、多くの異なる症状を発症するリスクがあります(腋窩そばかす、カフェオレ斑)。この障害が認知と神経発達に及ぼす影響はますます認識されており、NF1患者は学習障害、多動性、および自閉症スペクトラム障害の発生率の増加を示しています11,12,13。しかし、患者13、14、15、16、17の間でこれらの表現型の発達には有意な不均一性があり、一部の患者が重大な認知障害を示し、他の患者が影響を受けない理由は不明です。母親の食事誘発性肥満は、一般集団18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28の学習と行動に同様に影響を与えることが示されていますから、NF1における母親の食事曝露の違いが、この臨床的不均一性の1つの原因である可能性があることを示唆しています。特に、肥満の母親の子供は、多動性18,19,20,23,25,26、自閉症19,24,27、実行機能障害21,23を発症するリスクが高く、フルスケールIQスコア22,28が低くなります.しかし、NF1の患者は、肥満や糖尿病の発生率の低下など、一般集団と比較して代謝表現型が変化しており29,30,31、食事刺激と同様に反応するかどうかは不明です。

これらの疑問に答えるために、 Nf1 の胎児の仔における肥満食療法による主要栄養素プロファイルの変化が神経発達の変化に寄与しているかどうかを検討したいと考えました。我々は以前に、胎児の脳32から神経発達への応用に適した高品質の全体および領域的に微小解剖された組織を収集してきた。しかし、胎児の採血は、体が小さく、血液量が少ないため困難です33。斬首後の重力を利用したドレナージによる採血は、サンプル中の採血量が少なく、溶血が著しいことにつながり、下流のアプリケーションの解釈に影響を与える可能性があります。胎児の心臓または胸部血管からの吸引による採取は、以前に報告されているように33、技術的に困難であり、頻繁な溶血ももたらした。そこで、特殊な毛細血管チューブを利用して、大きなせん断応力なしに大量の採取を可能にする胎児血清採取法を開発しました。

ここでは、子宮内で高脂肪、高糖の食事と対照の食事に曝露されたNf1ヘテロ接合体の子犬から胚の脳と胎児の血清を同時に収集するこの方法を紹介します(図1および補足表S1)。脳は、免疫蛍光法によるその後の分析のためにクライオ包埋されたか、または分子生物学アプリケーションでのその後の使用のために領域的にマイクロ解剖され、瞬間凍結されました。高品位な血清が得られ、主要栄養素プロファイリングなどのダウンストリームアプリケーションに適しています。この方法を利用して、母親の高脂肪、高ショ糖の食事への曝露が、WTおよびNf1-ヘテロ接合性の子犬の両方で血清コレステロール値の上昇につながることを突き止めました。

プロトコル

この研究のすべての動物手順はNIHのガイドラインに従い、セントルイスのワシントン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。動物は、標準的な12時間のライト:ダークサイクリングと、食べ物と水への無料アクセスで収容されました。

1.母性ダイエット

  1. 雌マウスを4週齢でコントロールチャウ(CD)または肥満食(Ob)に置きます。
  2. 8〜12週齢で、早朝にダムの粘液栓を監視して時限交配を設定し、正しい収集年齢を決定します。食事誘発性肥満を確認するには、交配時に雌の体重を量ります。
    注:肥満食を与えられた女性が、8週齢までに常に発生したとは限らない、対応する女性と比較して太りすぎであることを確認するために、最初の交配セットアップに8〜12週間の範囲が使用されました。プラグの日は胚の1日目(E1)と考えられており、この研究で使用されたすべての動物はE19で収集されました。胎児後期の時点は、この時期に肥満食に曝露された動物で以前に観察された神経発達の変化のために選択されました(データは示されていません)。

2.ダムからの胎児の除去

  1. まず、母が妊娠しているように見えることを確認します(腹部の形と膨満感、腹部の触診、または胎児の動き)。疑わしい場合は、体重増加を測定するために女性の体重を再度測定します。
    注:後期妊娠マウスは、少なくとも3〜4 gの体重増加を示す必要があります。所望の時間枠で受胎の可能性を高めるために、雄のケージからの汚れた(尿およびフェロモンを含む)おがくずを交尾の3日前から毎日雌のケージに追加して発情を誘発することができる34。
  2. 3 mLのイソフルランが入ったペーパータオルでダムをチャンバーに入れて安楽死させ、ダムと麻酔薬を染み込ませたペーパータオルが直接接触しないように注意します。動物を鎮静させた後、ペーパータオルの上に置き、尻尾で持ち、首に解剖ハサミを置き、次にハサミを頭に向かって上向きに押し上げて子宮頸部脱臼を行います。あるいは、イソフルラン鎮静後に斬首を行います。.
    注:血清は、このステップでダムから採取でき、以下に説明するのと同様の方法を使用しますが、より大きなキャピラリーチューブを使用します。これが望ましい場合は、頸椎脱臼ではなく斬首を行う必要があります。安楽死の直前のイソフルランの投与によって関心のある表現型が変更されないように注意する必要があります。.
  3. ダムの腹側を上にして、100mmの皿に置きます。腹部を覆う皮膚をつまみ、解剖ハサミで正中線切開を行います。正中線切開に対して垂直に追加の切開を行い、胚を含む子宮を露出させるための皮膚フラップを作成します。
  4. 子宮を腹腔から引き出します。はさみを使用して、子宮をダムから切り離します。胚が入った無傷の胚嚢(「ひもについた真珠」)を、冷たく滅菌した1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れた皿に入れます。胎児の皿を氷の上に置きます。
    注:各同腹仔には通常、脳と血清の両方で収穫される6〜10匹の子犬が含まれているため、胎児は組織の劣化を避けるために氷上に保管されます。子犬を氷の上に置くと、母親の安楽死だけでは必ずしも十分ではない可能性があるため、子犬の適切な安楽死がさらに保証されます。血清採取のみが必要な場合は、室温採取が好ましい場合があります。.

3. 胎児血清コレクション

  1. #5鉗子で慎重に解剖することにより、胎児を胚嚢から取り出します。新鮮な冷たく滅菌された1x PBSを備えた湾曲した鉗子を使用して、胚を皿に移します。
  2. ペーパータオルで動物をやさしく拭き取り、標本から残留羊水とPBSを取り除きます。
  3. 動物の腹部を持ってください。腹側の首を切開することにより、マイクロハサミで動物を部分的に斬首します。血管が切断されているが、頭を保持している皮膚はまだ付着していることを確認してください。
    注:体と頭から同時に血液を採取できるように、頭は取り付けたままにしておく必要があります。
  4. 切開部を下に向けて、ボディを45°の角度で保持します。50μLのミニベット(毛細管)を、血液が液滴を形成するダムの切開部位と平行に保持します。50μLのキャピラリーチューブを慎重に血液で満たします。
    注:キャピラリーチューブx2または100μLのキャピラリーチューブを使用して、最大~75μLの血液を採取できます。
  5. さらに組織を採取するために、冷たく滅菌した1x PBSを含む新鮮な60 mm皿にヘッドを置きます(セクション4)。
  6. 血液が毛細血管内に入ったら、プランジャーを1.5mLチューブにすばやく押し込みます。チューブをフリックするか、すばやく回転させて、血液がチューブの底にあることを確認します。
  7. 残りのゴミについても繰り返します。
    注:子犬を氷の上に保ち、間をすばやく移動することは、収集量を制限する死後凝固のリスクを減らすために不可欠です。
  8. 室温で30分間血液を凝固させます。
  9. 血液サンプルを4°C、16,000 × gで20分間遠心分離します。
  10. 200 μLピペットで血清を新鮮な500 μLチューブに移し、チューブの底にある血球ペレットを乱さないようにします。
    注:血清は、赤い破片のない麦わら色である必要があります。.各胎児は15〜30μLの血清を産出する必要があります。.
  11. 採取した血清は-80°Cで保存してください。

4.胎児の脳のコレクション

  1. 解剖顕微鏡を覗いて、湾曲した鉗子で鼻を持ち、#5鉗子で頭蓋骨キャップの皮膚を慎重に剥がし、鼻に取り付けて持ちやすくします。角度#5鉗子を頭蓋骨に対して45°にし、発達中の頭蓋骨である透明な膜に慎重に穴を開け、鉗子を頭蓋骨に平行にシフトし、頭蓋骨キャップの下に挿入し、次につまんで片側に剥がします。片面を剥がした後、残りの面を#5鉗子でつかみ、反対側に剥がします。
  2. マイクロスプーンを使用して頭蓋骨から脳をそっとすくい取り、冷たい1x PBSが入った新鮮な60mmの皿に脳を移します。
    注:この時点で、全脳を固定して免疫染色のために埋め込むことができます。以前に公開された方法論32を参照してください。
  3. 他の分子アプリケーションのために組織をスナップ凍結する必要がある場合は、対象領域をサブダイスニングします。外側脳室、第3脳室、および第4脳室周辺の脳室周囲組織の分離について、以下に説明します。
    1. 湾曲した鉗子を使用して、後脳と前脳の接合部で脳を非利き手で保持します。利き手で、刃を脳の表面と平行にしてメスを持ちます。皮質中央部をしっかりと押し下げます(図1)。
    2. 後脳を保持したまま、後脳の前に2回目の切開を行い、前脳から分離します(図1)。最前部のセクションで、水平面内にある2つの小さな半円形のスペース、つまり側脳室を探します。各心室の中央に配置された湾曲した鉗子を使用して脳を所定の位置に保持し、#5鉗子を使用して内壁を慎重に解剖し、新鮮で清潔な1.5mLの微量遠心チューブに移します。
    3. 中央部で、腹面の小さな線形空間、つまり第3脳室を探します。#5鉗子を使用して、心室表面の両側の内壁を慎重につまんでから、新鮮で清潔な1.5mLの微量遠心チューブに移します。
    4. 最も後部のセクションで、後脳の中心にある小さな線形空間、つまり第4脳室を探します。#5鉗子を使用して両側の内壁を解剖し、新鮮で清潔な1.5mL微量遠心チューブに移します。
      注:後脳をスライスすることがきれいなカットでない場合、第4脳室組織が不明瞭になったり、破壊されたりする可能性があります。
    5. ステップ4.3.2-4.3.4では、組織をマイクロ遠心チューブに入れた直後に、液体窒素が入ったクライオセーフ容器にチューブを素早く入れます。
      注:チューブは、残りのサンプルが解剖されるまで液体窒素に保持できます。注意: 液体窒素は重度の凍傷を引き起こす可能性があります。液体窒素に直接手を突っ込んだり、飛沫を避けたりしないでください。
    6. 凍結したチューブをドライアイスの上に置き、凍結した組織を使用まで-80°Cの冷凍庫に移します。

結果

この技術によって得られた脳組織の質を説明するために、我々は、以前に報告された技術32に従ってGFAPについて免疫染色されたNestin−CFPnucマウス35からのサンプル胎児脳を示す。Nestin+細胞が側脳室の内側を覆っているのが見られ(図2A)、表面からGFAP+フィラメントが伸びています。CDの側脳室に...

ディスカッション

マウスから血液を採取する従来の方法には、球後静脈、尾静脈、伏在静脈、顔面静脈、および頸静脈出血40,41,42が含まれる。残念ながら、これらの方法は、動物のサイズと小さくて繊細な血管系のために、胚の採血には理想的ではありません。斬首後の重力を利用したドレナージによる採血は、サ...

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

N Brossierは、神経線維腫症治療加速プログラム(NTAP、助成金#210112)によって資金提供された神経線維腫症臨床およびトランスレーショナル研究のフランシスS.コリンズ奨学生プログラムによってサポートされています。この出版物は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部のNTAPからの資金提供によって部分的に支援されました。その内容は著者の責任であり、必ずしもジョンズ・ホプキンス大学医学部の公式見解を表すものではありません。St. Louis Children's Hospital(FDN-2022-1082からNMB)およびWashington University in St. Louis Diabetes Research Core(NIH P30 DK020579)による追加支援。顕微鏡検査は、ワシントン大学医学部、ワシントン大学小児発見研究所、セントルイス小児病院(CDI-CORE-2015-505およびCDI-CORE-2019-813)およびバーンズ・ユダヤ病院財団(3770および4642)の支援を受けて、ワシントン大学細胞イメージングセンター(WUCCI)を使用して実施しました。Nestin-CFPnuc35マウスは、Grigori Enikolopov氏(ルネッサンス医学部、ストーニーブルック大学、ニューヨーク州)から提供され、R681XまたはC383X生殖細胞変異32,38,39のいずれかに対してヘテロ接合性のNf1マウスは、David Gutmann氏(ワシントン大学医学部、ミズーリ州セントルイス)から寛大に提供されました。図 1 は BioRender.com を使用して作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
#5/45 ForcepsDumont 11251-35tip shape: angled 45°
4200 TapestationAgilentG2991BAVerify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen ContainerThermo Fisher2122Or other cryo-safe container
Control ChowPicoLab5053Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved ForcepsCole ParmerUX-10818-25Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handleCole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection ScissorsElectron microscope sciences72996-015½" (139.7 mm), Straight
GFAP AntibodyAbcamab7260Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11MYCO medical2001T-11#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoonAz ScilabA2Z-VL001stainless steel, autoclavable
Micro scissorsRubis78180-1C3model 1C300
Minivette POCT neutralSarstedt17.2111.050nominal volume: 50 µL, without preparation
NanoropThermo Fisher13-400-519Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic dietResearchdiets.comD12331High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol ReagentThermo FisherTR13421Colorimetric detection
β-actin antibodyCell Signaling8457Dilute 1:1,000.

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