تحسين تصور النقل المحوري للبضائع الداخلية بواسطة الفحص المجهري الفلوري في التهاب Caenorhabditis elegans الحي

Summary

تصف الورقة تحسين معلمات اكتساب الفحص المجهري الفلوري لتصور النقل المحوري للشحنات الموسومة الداخلية بدقة خلية عصبية واحدة في الديدان الخيطية الحية.

Abstract

يعد النقل المحوري شرطا أساسيا لتوصيل البروتينات المحورية من موقع تخليقها في جسم الخلية العصبية إلى وجهتها في المحور العصبي. وبالتالي ، فإن فقدان النقل المحوري يضعف نمو الخلايا العصبية ووظيفتها. ومن ثم، فإن دراسة النقل المحوري تحسن فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية. مع التحسينات الأخيرة في تحرير جينوم CRISPR Cas9 ، أصبح وضع العلامات الداخلية للشحنات المحورية متاحا ، مما يتيح تجاوز التصور القائم على التعبير خارج الرحم للنقل. ومع ذلك ، غالبا ما يأتي وضع العلامات الداخلية على حساب كثافة الإشارة المنخفضة ويستلزم استراتيجيات التحسين للحصول على بيانات قوية. هنا ، نصف بروتوكولا لتحسين تصور النقل المحوري من خلال مناقشة معلمات الاستحواذ ونهج التبييض لتحسين إشارة البضائع الموسومة الداخلية على خلفية السيتوبلازم المنتشرة. نحن نطبق بروتوكولنا لتحسين تصور سلائف الحويصلة المشبكية (SVPs) الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) RAB-3 لتسليط الضوء على كيف يمكن لمعلمات الاكتساب الدقيقة أن تحسن تحليل البضائع المحورية الموسومة داخليا في Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

تعتمد الخلايا العصبية طوال الحياة على النقل المحوري لتوصيل البروتينات والليبيدات والجزيئات الأخرى من جسم الخلية إلى وجهتها النهائية في المحور. وبالتالي ، يرتبط ضعف النقل المحوري بفقدان الوظيفة العصبية وغالبا ما يشارك في أمراض الاضطرابات التنكسية العصبية ^1,2. ومن ثم ، فإن فهم الآليات التي يقوم عليها النقل المحوري له أهمية كبيرة.

كشفت عدة عقود من الأبحاث حول النقل المحوري عن العديد من الأفكار المهمة حول الآلية الجزيئية التي تتوسط هذا النقل وتكوينها وكذلك الآليات التنظيمية. يحدث النقل المحوري بعيد المدى على الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة، والذي يتكون م....

Protocol

للحصول على بروتوكول مفصل حول كيفية الحفاظ على الديدان الخيطية وإعدادها لتصوير الخلايا الحية ، راجع عمل S.Niwa ⁷.

1. توليد سلالة الدودة

بالإضافة إلى توليد سلالات الديدان الخيطية ، يحتوي مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ على مجموعة متزايدة من سلالات الديدان الخيطية مع بروتينات موسومة داخليا يمكن الحصول عليها مباشرة من صفحة الويب الخاصة بهم.

1. اختيار استراتيجية وضع العلامات الفلورية
   1. استخدم سلالة الديدان الخيطية MTS1161 ، التي تحتوي على أليل rab-3 (ox699)⁶ ، لتصور GFP الدا....

النتائج

نظرة عامة على النظام النموذجي وإجراءات القياس
لتصور النقل المحوري لسلائف الحويصلة المشبكية ، تتبعنا GFP داخليا المسمى RAB-3. هنا نستفيد من GFP :: Flip-on::RAB-3 سلالة⁶ التي تم إنشاؤها مؤخرا ، حيث يؤدي التعبير عن Flippase recombinase تحت مروج خاص بالخلية (glr-4p) إلى تس.......

Discussion

حدود الطريقة والطرق البديلة
في هذا البروتوكول ، قمنا بتحسين معلمات الاستحواذ لتصور النقل المحوري ل RAB-3 الموسوم داخليا ، والذي يرتبط بسلائف الحويصلة المشبكية. لتصور RAB-3 ، استخدمنا FLIP-on :: GFP ::^RAB-3 الذي تم نشره مؤخرا سلالة 6 وعبرنا عن Flippase recombinase تحت مرو.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)