Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Riepilogo

L'articolo descrive l'ottimizzazione dei parametri di acquisizione al microscopio a fluorescenza per visualizzare il trasporto assonale di carichi marcati endogeni con risoluzione di un singolo neurone in un nematode vivente.

Abstract

Il trasporto assonale è un prerequisito per trasportare le proteine assonali dal loro sito di sintesi nel corpo cellulare neuronale alla loro destinazione nell'assone. Di conseguenza, la perdita del trasporto assonale compromette la crescita e la funzione neuronale. Lo studio del trasporto assonale migliora quindi la nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali. Con i recenti miglioramenti nell'editing del genoma CRISPR Cas9, la marcatura endogena dei carichi assonali è diventata accessibile, consentendo di andare oltre la visualizzazione del trasporto basata sull'espressione ectopica. Tuttavia, la marcatura endogena spesso comporta una bassa intensità del segnale e richiede strategie di ottimizzazione per ottenere dati affidabili. Qui, descriviamo un protocollo per ottimizzare la visualizzazione del trasporto assonale discutendo i parametri di acquisizione e un approccio di sbiancamento per migliorare il segnale del carico marcato endogeno su un fondo citoplasmatico diffuso. Applichiamo il nostro protocollo per ottimizzare la visualizzazione dei precursori delle vescicole sinaptiche (SVP) marcati da RAB-3 marcati con proteina fluorescente verde (GFP) per evidenziare come la regolazione fine dei parametri di acquisizione possa migliorare l'analisi del carico assonale marcato endogenamente in Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduzione

Per tutta la vita, i neuroni si affidano al trasporto assonale per trasportare proteine, lipidi e altre molecole dal corpo cellulare alla loro destinazione finale nell'assone. Di conseguenza, la compromissione del trasporto assonale è associata a una perdita della funzione neuronale ed è spesso coinvolta nella patologia delle malattie neurodegenerative ^1,2. Quindi, comprendere i meccanismi che sono alla base del trasporto assonale è di grande interesse.

Diversi decenni di ricerca sul trasporto assonale hanno rivelato molte importanti intuizioni sul ....

Protocollo

Per un protocollo dettagliato su come mantenere e preparare i nematodi per l'imaging di cellule vive, fare riferimento al lavoro di S.Niwa ⁷.

1. Generazione di ceppi di vermi

Oltre a generare ceppi di nematodi, il Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ contiene una collezione crescente di ceppi di nematodi con proteine marcate endogenamente in fluorescenza che possono essere ottenute direttamente dalla loro pagina web.

1. Scelta della strategia di marcatura a fluorescenza
   1. Utilizzare il ceppo nematode MT....

Discussione

Limitazioni del metodo e metodi alternativi
In questo protocollo, abbiamo ottimizzato i parametri di acquisizione per visualizzare il trasporto assonale di RAB-3 marcato endogenamente, che è associato ai precursori delle vescicole sinaptiche. Per visualizzare RAB-3, abbiamo fatto uso di un ceppo⁶ di FLIP-on::GFP::RAB-3 pubblicato di recente e abbiamo espresso la ricombinasi Flippasi sotto un promotore specifico per la cellula (glr-4p)

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)