АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В работе описана оптимизация параметров сбора данных флуоресцентной микроскопии для визуализации аксонального транспорта эндогенных меченых грузов с однонейронным разрешением у живой нематоды.

Аннотация

Аксональный транспорт является необходимым условием для доставки аксональных белков от места их синтеза в теле нейронной клетки к месту их назначения в аксоне. Следовательно, потеря аксонального транспорта нарушает рост и функцию нейронов. Таким образом, изучение аксонального транспорта улучшает наше понимание биологии нейрональных клеток. С недавними улучшениями в редактировании генома CRISPR Cas9 эндогенная маркировка аксональных грузов стала доступной, что позволило выйти за рамки визуализации транспорта на основе эктопической экспрессии. Тем не менее, эндогенная маркировка часто происходит за счет низкой интенсивности сигнала и требует стратегий оптимизации для получения надежных данных. В данной статье мы описываем протокол оптимизации визуализации аксонального транспорта путем обсуждения параметров сбора данных и подхода к отбеливанию для улучшения сигнала эндогенного меченого груза на диффузном цитоплазматическом фоне. Мы применяем наш протокол для оптимизации визуализации предшественников синаптических везикул (SVP), меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), меченным RAB-3, чтобы показать, как тонкая настройка параметров сбора может улучшить анализ эндогенно меченого аксонального груза у Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Введение

На протяжении всей жизни нейроны полагаются на аксональный транспорт для доставки белков, липидов и других молекул из тела клетки к их конечному пункту назначения в аксоне. Следовательно, нарушение аксонального транспорта связано с потерей функции нейронов и часто участвует в патологии нейродегенеративных расстройств 1,2. Следовательно, понимание механизмов, лежащих в основе аксонального транспорта, представляет большой интерес.

Несколько десятилетий исследований аксонального транспорта позволили получить много важных сведений о молекулярных механизмах, которые опосредуют этот транспорт, их составе, а также регуляторных механизмах. Дальний аксональный транспорт происходит на цитоскелете микротрубочек, который состоит из частично перекрывающихся полимеров микротрубочек, которые обычно ориентированы плюсовым концом наружу в аксонах3. Следовательно, антероградный транспорт опосредован моторными белками, которые идут к плюсовому концу микротрубочек, кинезинам, тогда как ретроградный транспорт зависит от мотора, направленного на минус конец. Несмотря на то, что многие аспекты транспорта были раскрыты, для многих аксональных белков до сих пор остается неясным, как они загружаются в транспортный механизм, как организованы отдельные транспортные пакеты икак регулируется этот транспорт.

Аксональный транспорт первоначально изучался в экспериментах по радиоактивному мечению, в которых радиоактивно меченые аминокислоты вводились в соматический компартмент, где они включались в зарождающиеся эндогенные белки и могли быть прослежены с течением времени в аксональном компартменте с помощью авторадиографии4. Несмотря на то, что эксперименты по радиоактивному мечению позволили изучить аксональный транспорт эндогенных белков in vivo, они не позволяют напрямую следить за поведением отдельного груза для получения механистических идей4. Это ограничение было преодолено с помощью флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, аксональный транспорт часто визуализируется не на эндогенных белках, а посредством экспрессии флуоресцентной меченой копии. Особенно для белков с низкой экспрессией, сверхэкспрессия обеспечивает более высокую интенсивность сигнала, что делает возможной визуализацию, предпочтительно с разрешением одного нейрона. Более того, эктопическая экспрессия флуоресцентного меченого белка обходит необходимость и проблемы редактирования генома. И наоборот, утверждалось, что поведение эктопически выраженного груза может отличаться от поведения эндогенногогруза5.

Недавние усовершенствования в редактировании генома сделали стратегии эндогенного мечения более доступными. Следовательно, более низкая интенсивность сигнала стала основным ограничением для изучения аксонального транспорта груза путем эктопической экспрессии, а не эндогенной маркировки. Тщательный анализ стратегии эндогенной маркировки в сочетании с оптимизацией условий приобретения может решить эту проблему.

Нематоды представляют собой отличную исследовательскую модель для изучения аксонального транспорта in vivo благодаря их прозрачности и простоте в генетических манипуляциях. В этом протоколе мы описываем исследовательскую стратегию для визуализации аксонального транспорта эндогенных белков с разрешением одного нейрона у живых Caenorhabditis elegans. Мы визуализируем аксональный транспорт предшественников синаптических везикул с помощью штамма, созданного лабораторией Йоргенсена6, в котором везикула-ассоциированная RAB GTPase, RAB3, эндогенно помечена GFP в моторном нейроне DA9. Задаваясь вопросом о том, как небольшие изменения в различных параметрах регистрации и фотообесцвечивании могут улучшить визуализацию отдельных событий переноса, протокол дает идеи о том, как оптимизировать условия визуализации.

протокол

Подробный протокол о том, как поддерживать и подготавливать нематод для визуализации живых клеток, см. в работе S.Niwa 7.

1. Генерация штамма червя

В дополнение к генерированию штаммов нематод, Генетический центр Caenorhabditis (CGC)8 содержит растущую коллекцию штаммов нематод с эндогенно флуоресцентно помеченными белками, которые можно получить непосредственно с их веб-страницы.

  1. Выбор стратегии флуоресцентного мечения
    1. Используйте штамм нематоды MTS1161, который содержит аллельrab-3(ox699) 6, для визуализации эндогенного GFP, меченного RAB-3, в моторном нейроне DA9 (штамм будет отложен в CGC). Чтобы визуализировать другие аксональные белки, сгенерируйте штамм нематоды с эндогенным меченым белком, используя протокол редактирования CRISPR Cas9 из Mello Lab9.
      Примечание: MTS1161 использует рекомбинационный подход для специфической маркировки RAB-3 клеткой эндогенно с помощью метки GFP6. Распространенный альтернативный подход основан на восстановлении расщепленного флуоресцентного белка, который рекомендуется для белков с особенно низкой экспрессией, поскольку он увеличивает число флуоресцентных копий на эндогенный белок за счет использования нескольких расщепленных флуоресцентных копий10. Количество копий может быть первоначально оценено на основе наборов данных транскриптома с веб-страницы CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) 11.
  2. Выбор нейрона для визуализации аксонального транспорта
    1. В MTS1161 штамма визуализируйте RAB-3 в моторном нейроне DA9 (см. рис. 1). Для других аксональных грузов, особенно белков с низкой экспрессией, определите нейрон, в котором уровни экспрессии анализируемого белка являются самыми высокими, используя веб-страницу CenGen.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проект CenGen (cengen.org) предоставляет отличный онлайн-ресурс для оценки уровней экспрессии белка, представляющего интерес во многих нейронах нематоды, на основе большого набора транскриптомных данных, охватывающего все 302 нейроны нервной системы C. elegans 12,13.

2. Работа с червями и подготовка к визуализации

  1. Поддерживайте нематод на лужайке из бактерий (штамм: OP50), посеянных на пластинах питательной среды для нематод при температуре 20 °C и выращенных до возраста 1 дня во взрослом возрасте для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение транспорта аксонов на определенной возрастной стадии важно, поскольку скорость переноса снижается с последовательным старением различных аксональных грузов, классов нейронов и организмов 14,15,16,17,18-Нематоды на личиночной стадии L4 или через 1 день взрослого возраста были использованы в большинстве работ и, таким образом, предлагают самые большие наборы данных для сравнения.
  2. Подготовьте нематод к визуализации живых клеток: выполните все последующие шаги с помощью стереомикроскопа для визуализации и работы с червями.
    1. Перенесите нематод в каплю 0,5 мМ левамизола с помощью медиатора из платиновой проволоки и инкубируйте нематоды в течение 20 минут в капле.
    2. Осторожно внесите 10-20 нематод из капли левамизола в каплю среды М9 объемом 12 мкл на 10% агарозном (растворенном в среде М9) участке на предметном стекле с помощью пилки. Подробную процедуру изготовления 10% агарозного пластыря можно найти в протоколе S.Niwa7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно установить небольшое количество нематод, так как только несколько животных будут изображены на одном слайде, прежде чем животные начнут страдать от гипоксии.
    3. Поместите крышку на каплю сверху (22 мм x 22 мм или 18 мм x 18 мм). Для переноса изображений в аксоне DA9 расположите аксон близко к защитному листу. Для этого поверните защитный лист на 45° после того, как поместите его поверх агаровой грядки, чтобы перевернуть животных на спину.
    4. Запечатайте пространство между защитным стеклом и предметным стеклом вязким гелем, таким как вазелин. Это предотвратит высыхание агарозного пятна, что может привести к тому, что нематоды выйдут за пределы поля визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно обращаться с животными как можно мягче. Слишком высокие концентрации левамизола или физическое повреждение червя могут нарушить аксональный транспорт. Легкие подергивания хвоста во время сеанса визуализации являются хорошим признаком того, что животное остается в здоровом состоянии. Животные остаются здоровыми и даже могут восстановиться после сеанса визуализации.

3. Микроскопия живых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Точные значения параметров сбора данных могут отличаться в зависимости от микроскопа. Однако тренды для каждого параметра сбора данных должны быть независимыми от используемого микроскопа. В этом протоколе использовался конфокальный микроскоп с вращающимся диском, который был оснащен отдельной лазерной линией для отбеливания (подробнее о микроскопе см. в Таблице материалов ). Зеленая флуоресценция возбуждалась лазером с длиной волны 488 нм, а излучение фильтровалось эмиссионным фильтром ET525/36. Отбеливание проводилось с помощью лазерной линии с длиной волны 488 нм.

  1. Убедитесь, что температура в помещении или, если имеется ступень с регулируемой температурой, установлена на постоянную температуру. Для нематод установите температуру 20 °C.
  2. Установите предметное стекло и используйте объектив с 4-20-кратным увеличением, чтобы найти нематод на предметном стекле и запомнить положение. Переключитесь на объектив с 63-кратным увеличением для получения изображений.
  3. Сделайте один снимок, чтобы проверить первоначальные параметры захвата. Отслеживайте интенсивность сигнала в поле зрения с помощью гистограммы интенсивности программного обеспечения для сбора данных. Значения интенсивности должны охватывать нижнюю треть максимального сигнала, который может обнаружить камера. Избегайте насыщения пикселей. Увеличьте интенсивность возбуждающего лазера, если интенсивность сигнала слишком низкая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте лазер слишком высокой интенсивности возбуждения, так как он отбеливает флуоресцентный белок во время покадровой съемки.
  4. Измените параметр сбора данных и выполните следующие действия для оптимизации обнаружения флуоресцентного сигнала.
    1. Реализация этапа отбеливания: Отбеливайте область аксона, которая будет анализироваться, с помощью лазерной линии 488 нм (мощность: 15 мВт) для этапа отбеливания. Стремитесь к эффективности отбеливания не менее 90%. Определите эффективность отбеливания, сравнив интенсивность сигнала в области до и после этапа отбеливания.
      Примечание: Обесцвечивание усиливает сигнал движущихся частиц за счет понижения сигнала, исходящего от неподвижных частиц, а также сигнала, исходящего от цитоплазматической фракции белка на заднем плане. Мембранозный груз, такой как RAB-3 на предшественниках синаптических везикул, имеет низкую цитоплазматическую фракцию, поэтому этап отбеливания лишь незначительно улучшает сигнал транспортной упаковки на цитоплазматическом фоне (рис. 2A, D). Тем не менее, обесцвечивание улучшает отслеживание отдельных событий переноса на большие расстояния и позволяет количественно оценить время паузы (рис. 2A).
    2. Биннинг: Используйте биннинг 2 x 2 для повышения интенсивности сигнала отдельных событий переноса. При группировании массивы пикселей объединяются в один большой пиксель. Это снизит пространственное разрешение, но повысит интенсивность сигнала отдельных событий переноса и особенно полезно для тусклых частиц (рис. 2B, D).
    3. Время воздействия: Увеличьте время воздействия для повышения интенсивности сигнала. Увеличение времени экспозиции увеличивает интенсивность сигнала образца за счет получения более низкого временного разрешения для событий переноса. Для данного эксперимента используйте временное разрешение от 300 мс до 700 мс между последовательными временными точками (время экспозиции 100–500 мс), чтобы следить за отдельными событиями переноса RAB-3. (Рисунок 2C,D)
  5. Покадровая запись: Сделайте таймлапс не менее 1-3 минут в зависимости от интенсивности сигнала белка, а также частоты отдельных транспортных событий. После того, как таймлапс был зафиксирован, перейдите к следующему животному. Изображения животных на предметном стекле не должны длиться более 30 минут, чтобы убедиться, что запечатленные животные находятся в здоровом состоянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие подергивания хвоста животного во время записи являются показателем того, что животное все еще живо.

4. Анализ данных аксонального транспорта

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ImageJ/Fiji19 для последующих этапов анализа изображений. Фиджи может считывать данные с помощью всех распространенных пакетов программного обеспечения для микроскопии.

  1. Генерация кимографа
    1. Импорт данных: Импорт файла данных интервальной съемки на Фиджи. В случае, если он не может импортировать данные на Фиджи, экспортируйте запись времени в виде файла tiff из программного пакета и загрузите его впоследствии на Фиджи.
    2. Коррекция смещения: проверьте, двигался ли или слегка дрейфовал сегмент животного/аксона во время получения изображения. Исправьте движение животных или дрифт, запустив плагин StackReg20. При запуске плагина выберите трансформацию «Твердое тело ».
    3. Ручная генерация кимографа: Подробная пошаговая процедура представлена на рисунке 3. Используйте фильм с коррекцией дрейфа для создания кимографа. Используйте инструмент «Сегментированная линия» и отрегулируйте ширину линии в соответствии с диаметром аксона, дважды щелкнув левой кнопкой мыши по значку сегментированной линии, чтобы провести линию вдоль сегмента аксона, который будет анализироваться. Запустите плагин ImageJ/Fiji Kymoreslicewide, чтобы сгенерировать кимограф и использовать максимальное значение интенсивности по ширине линии в настройках параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение постоянства в направлении рисования линий (например, всегда проксимальнее дистального аксона или наоборот) упрощает трассировку направления движения в обратном направлении на кимографах.
  2. Анализ транспортного параметра
    1. Рассчитайте транспортный параметр: номер события, скорость, длину прогона и продолжительность паузы из кимографа, следуя последующим шагам.
      1. Трассировка событий переноса в кимографе: Используйте инструмент «Прямая линия» для трассировки отдельных событий переноса на кимографе. Сохраняйте каждую строку в менеджере ROI и отслеживайте все события переноса в кимографе. Выберите следующие параметры измерения в ImageJ/Fiji: Площадь, Ограничивающий прямоугольник, Среднее значение серого, Диаметр Ферета.
      2. Вычислить параметр переноса: вставьте таблицу результатов в таблицу и используйте следующие столбцы разделов результатов для вычисления:
        Длина прогона: умножьте ширину (в пикселях) на разрешение камеры (например, x μм/pxl), чтобы определить длину прогона в μм.
        Velocity: Длина бега/Продолжительность бега. Чтобы определить продолжительность события движения в секундах, умножьте высоту (в пикселях) на время сбора данных между последовательными временными точками (например, x s/пиксель).
        Время паузы: продолжительность пробега между двумя последовательными движениями, скорость которых равна 0.
        Номер события: Общее количество событий может быть нормализовано на общую длину кимографа, чтобы определить количество событий в минуту и сегмент длины аксона. В свою очередь, события можно разделить на антероградные и ретроградные транспортные события. Чтобы определить направленность каждого события движения, используйте инструмент «Угол ферета». В кимографах, которые изначально были построены путем проведения сегментированной линии от проксимального к дистальному, а события антероградного переноса на кимографе направлены справа налево, угол Ферета < 90° будет указывать на антероградное событие, а >90° — на ретроградное событие, в противном случае все будет наоборот.

Результаты

Обзор модельной системы и методики измерений
Чтобы визуализировать аксональный транспорт предшественников синаптических везикул, мы проследили эндогенно меченый GFP RAB-3. Здесь мы используем недавно сгенерированныйштамм 6 GFP::Flip-on::RAB-3, в котором...

Обсуждение

Ограничения метода и альтернативные методы
В этом протоколе мы оптимизировали параметры сбора данных для визуализации аксонального транспорта эндогенно меченого RAB-3, который связан с предшественниками синаптических везикул. Для визуализации RAB-3 мы испол...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории Йогева и Хаммарлунда за техническую помощь, отзывы и обсуждения. Мы хотели бы выразить особую благодарность Грейс Суэйм за руководство по визуализации живых клеток, а также Грейс и Брайана Суэйма за первоначальную организацию ручного анализа кимографа в лаборатории. OG поддерживается стипендией Вальтера-Беньямина, финансируемой Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) -Project# 465611822. SY финансируется за счет гранта NIH R35-GM131744.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover GlassThomas Scientific6672A14
LevamisoleChemCruzsc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filterNikonSpinning Disc Confocal Microscope
 NIS-elements ARNikonSoftware for the Nikon Ti2 
Plain precleaned microscopy slidesThermo Scientific420-004T
Nematode strainIdentifierSource
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161 Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)

Ссылки

  1. Millecamps, S., Julien, J. P. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).
  2. Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
  3. Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44 (2015).
  4. Roy, S. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).
  5. Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568 (2023).
  6. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  7. Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690 (2017).
  8. Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota Available from: https://cgc.umn.edu/ (2023)
  9. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).
  10. He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
  11. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  12. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  13. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  14. Takihara, Y. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  15. Li, L. B. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).
  16. Viancour, T. A., Kreiter, N. A. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).
  17. Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).
  18. Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  21. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  22. Hall, D. H., Russell, R. L. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).
  24. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1 (1986).
  25. Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).
  26. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Goudeau, J., et al. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).
  29. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  30. Fan, X., et al. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), 635-644 (2020).
  31. Glomb, O., et al. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Caenorhabditis elegansCRISPR Cas9RAB 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены