אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

Summary

המאמר מתאר אופטימיזציה של פרמטרים לרכישת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של מטענים מסומנים אנדוגניים ברזולוציה של נוירון יחיד בנמטודה חיה.

Abstract

הובלה אקסונלית היא תנאי מוקדם להעברת חלבונים אקסונליים מאתר הסינתזה שלהם בגוף התא העצבי ליעדם באקסון. כתוצאה מכך, אובדן הובלה אקסונלית פוגע בגדילה ובתפקוד העצביים. חקר התחבורה האקסונלית משפר אפוא את הבנתנו את הביולוגיה של התא העצבי. עם השיפורים האחרונים בעריכת הגנום של CRISPR Cas9, תיוג אנדוגני של מטענים אקסונליים הפך לנגיש, ומאפשר להתקדם מעבר להדמיה מבוססת ביטוי חוץ רחמי של תחבורה. עם זאת, תיוג אנדוגני מגיע לעתים קרובות במחיר של עוצמת אות נמוכה ומחייב אסטרטגיות אופטימיזציה כדי להשיג נתונים חזקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לייעל את ההדמיה של תחבורה אקסונלית על ידי דיון בפרמטרים של רכישה וגישה הלבנה כדי לשפר את האות של מטען מסומן אנדוגני על רקע ציטופלזמי מפוזר. אנו מיישמים את הפרוטוקול שלנו כדי למטב את ההדמיה של מבשרי שלפוחית סינפטית (SVPs) המסומנים על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג RAB-3 כדי להדגיש כיצד כוונון עדין של פרמטרי רכישה יכול לשפר את הניתוח של מטען אקסונלי מסומן אנדוגנית ב- Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

במהלך החיים, תאי עצב מסתמכים על הובלה אקסונלית כדי להעביר חלבונים, שומנים ומולקולות אחרות מגוף התא ליעדם הסופי באקסון. כתוצאה מכך, פגיעה בתחבורה אקסונלית קשורה לאובדן תפקוד עצבי ולעתים קרובות מעורבת בפתולוגיה של הפרעות נוירודגנרטיביות ^1,2. לפיכך, הבנת המנגנונים העומדים בבסיס ההובלה האקסונלית היא בעלת עניין רב.

כמה עשורים של מחקר על הובלה אקסונלית חשפו תובנות חשובות רבות על המנגנון המולקולרי המתווך תחבורה זו, הרכבם כמו גם מנגנוני הבקרה. העברה אקסונלית ארוכת טווח מתרחשת על שלד הציטובול של המיקרוטובול, המורכב מפולימרים מיקרוטובולים חופפים חלקית שבדרך כ....

Protocol

לקבלת פרוטוקול מפורט כיצד לשמור ולהכין נמטודות לדימות תאים חיים, עיין בעבודתו של S.Niwa ⁷.

1. יצירת זן תולעים

בנוסף לייצור זני נמטודות, המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)⁸ מכיל אוסף גדל והולך של זני נמטודות עם חלבונים מתויגים פלואורסצנטית אנדוגנית שניתן להשיג ישירות מדף האינטרנט שלהם.

1. בחירת אסטרטגיית התיוג הפלואורסצנטי
   1. השתמש בזן הנמטודה MTS1161, המכיל את אלל RAB-3(ox699)⁶, כדי לדמיין GFP אנדוגני המסומן RAB-3 בנוירון המוטורי DA9 (הזן יופקד ב- CGC). כדי להמחיש חלבונים אקסונליים....

תוצאות

סקירה כללית של מערכת המודל והליך המדידה
כדי להמחיש הובלה אקסונלית של מבשרי שלפוחית סינפטית, עקבנו אחר GFP אנדוגני שכותרתו RAB-3. כאן אנו עושים שימוש בזן GFP שנוצר לאחרונה::Flip-on::RAB-3 זן⁶, שבו ביטוי של רקומבינאז פליפאז תחת מקדם ספציפי לתא (glr-4p) מתייג RAB-3.......

Discussion

מגבלות השיטה והשיטות החלופיות
בפרוטוקול זה, ביצענו אופטימיזציה של פרמטרי רכישה כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של RAB-3 המתויג אנדוגנית, המשויכת למבשרי שלפוחית סינפטית. כדי להמחיש את RAB-3, השתמשנו ב-FLIP-on::GFP::RAB-3 זן⁶ שפורסם לאחרונה וביטאנו את הרקומבינאז.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)