אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

Summary

המאמר מתאר אופטימיזציה של פרמטרים לרכישת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של מטענים מסומנים אנדוגניים ברזולוציה של נוירון יחיד בנמטודה חיה.

Abstract

הובלה אקסונלית היא תנאי מוקדם להעברת חלבונים אקסונליים מאתר הסינתזה שלהם בגוף התא העצבי ליעדם באקסון. כתוצאה מכך, אובדן הובלה אקסונלית פוגע בגדילה ובתפקוד העצביים. חקר התחבורה האקסונלית משפר אפוא את הבנתנו את הביולוגיה של התא העצבי. עם השיפורים האחרונים בעריכת הגנום של CRISPR Cas9, תיוג אנדוגני של מטענים אקסונליים הפך לנגיש, ומאפשר להתקדם מעבר להדמיה מבוססת ביטוי חוץ רחמי של תחבורה. עם זאת, תיוג אנדוגני מגיע לעתים קרובות במחיר של עוצמת אות נמוכה ומחייב אסטרטגיות אופטימיזציה כדי להשיג נתונים חזקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לייעל את ההדמיה של תחבורה אקסונלית על ידי דיון בפרמטרים של רכישה וגישה הלבנה כדי לשפר את האות של מטען מסומן אנדוגני על רקע ציטופלזמי מפוזר. אנו מיישמים את הפרוטוקול שלנו כדי למטב את ההדמיה של מבשרי שלפוחית סינפטית (SVPs) המסומנים על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג RAB-3 כדי להדגיש כיצד כוונון עדין של פרמטרי רכישה יכול לשפר את הניתוח של מטען אקסונלי מסומן אנדוגנית ב- Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

במהלך החיים, תאי עצב מסתמכים על הובלה אקסונלית כדי להעביר חלבונים, שומנים ומולקולות אחרות מגוף התא ליעדם הסופי באקסון. כתוצאה מכך, פגיעה בתחבורה אקסונלית קשורה לאובדן תפקוד עצבי ולעתים קרובות מעורבת בפתולוגיה של הפרעות נוירודגנרטיביות ^1,2. לפיכך, הבנת המנגנונים העומדים בבסיס ההובלה האקסונלית היא בעלת עניין רב.

כמה עשורים של מחקר על הובלה אקסונלית חשפו תובנות חשובות רבות על המנגנון המולקולרי המתווך תחבורה זו, הרכבם כמו גם מנגנוני הבקרה. העברה אקסונלית ארוכת טווח מתרחשת על שלד הציטובול של המיקרוטובול, המורכב מפולימרים מיקרוטובולים חופפים חלקית שבדרך כלל מכוונים עם קצה הפלוס שלהם החוצה באקסונים³. כתוצאה מכך, ההובלה האנטרוגרדית מתווכת על ידי חלבונים מוטוריים ההולכים לקצה הפלוס של מיקרוטובולים, קינזינים, בעוד שההובלה המדרדרית תלויה במנוע הדינאין המכוון לקצה המינוס. למרות שהיבטים רבים של הובלה נחשפו, עבור חלבונים אקסונליים רבים עדיין לא ברור, כיצד הם נטענים לתוך מכונות ההובלה, כיצד חבילות הובלה בודדות מאורגנות, וכיצד הובלה זו מוסדרת³.

הובלה אקסונלית נחקרה לראשונה בניסויי תיוג רדיו, שבהם הוזרקו חומצות אמינו רדיואקטיביות לתא הסומטי, שם הן שולבו בחלבונים אנדוגניים מתהווים וניתן היה לעקוב אחריהן לאורך זמן בתא האקסונלי על ידי אוטורדיוגרפיה⁴. למרות שניסויי תיוג רדיו אפשרו מחקר של הובלה אקסונלית של חלבונים אנדוגניים in vivo, הם אינם מאפשרים מעקב ישיר אחר התנהגותם של מטענים בודדים כדי לקבל תובנות מכניסטיות⁴. מגבלה זו התגברה עם השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, לעתים קרובות העברה אקסונלית אינה מומחשת על חלבונים אנדוגניים אלא על ידי ביטוי של עותק פלואורסצנטי מסומן. במיוחד עבור חלבונים בעלי ביטוי נמוך, ביטוי יתר מספק עוצמות אות גבוהות יותר אשר מאפשרות ויזואליזציה, רצוי ברזולוציה של נוירון יחיד. יתר על כן, ביטוי חוץ רחמי של החלבון המתויג הפלואורסצנטי עוקף את הצורך והאתגרים של עריכת גנום. לעומת זאת, נטען כי התנהגותו של מטען מבוטא אקטופית עשויה להיות שונה מהתנהגות המטען האנדוגני⁵.

שיפורים אחרונים בעריכת הגנום הפכו את אסטרטגיות התיוג האנדוגניות לנגישות יותר. לפיכך, עוצמת אות נמוכה יותר הפכה למגבלה העיקרית לחקר הובלה אקסונלית של מטען על ידי ביטוי חוץ רחמי במקום תיוג אנדוגני. שיקולים זהירים באסטרטגיית הסימון האנדוגנית בשילוב עם אופטימיזציה של תנאי הרכישה יכולים להתגבר על אתגר זה.

נמטודות מספקות מודל מחקר מצוין לחקר הובלה אקסונלית in vivo בשל שקיפותן וקלות המניפולציות הגנטיות שלהן. בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיית מחקר כדי לדמיין הובלה אקסונלית של חלבונים אנדוגניים עם רזולוציה של נוירון יחיד ב- Caenorhabditis elegans חיים. אנו מדמיינים את ההובלה האקסונלית של מבשרי שלפוחית סינפטית באמצעות זן שנוצר על ידי מעבדת יורגנסן⁶, שבה השלפוחית המשויכת ל- RAB GTPase, RAB3, מסומנת אנדוגנית עם GFP, בנוירון המוטורי DA9. על ידי השאלה כיצד התאמות קטנות בפרמטרים שונים של רכישה והלבנה יכולות לשפר את ההדמיה של אירועי הובלה בודדים, הפרוטוקול מספק רעיונות כיצד לייעל את תנאי ההדמיה.

Protocol

לקבלת פרוטוקול מפורט כיצד לשמור ולהכין נמטודות לדימות תאים חיים, עיין בעבודתו של S.Niwa ⁷.

1. יצירת זן תולעים

בנוסף לייצור זני נמטודות, המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)⁸ מכיל אוסף גדל והולך של זני נמטודות עם חלבונים מתויגים פלואורסצנטית אנדוגנית שניתן להשיג ישירות מדף האינטרנט שלהם.

1. בחירת אסטרטגיית התיוג הפלואורסצנטי
   1. השתמש בזן הנמטודה MTS1161, המכיל את אלל RAB-3(ox699)⁶, כדי לדמיין GFP אנדוגני המסומן RAB-3 בנוירון המוטורי DA9 (הזן יופקד ב- CGC). כדי להמחיש חלבונים אקסונליים אחרים, צור זן נמטודה עם חלבון מתויג אנדוגני באמצעות פרוטוקול העריכה CRISPR Cas9 ממעבדת Mello^{Lab 9}.
      הערה: MTS1161 משתמש בגישת רקומבינציה לתא ספציפי לתייג RAB-3 באופן אנדוגני עם תג GFP⁶. גישה חלופית נפוצה מבוססת על הרכבה מחדש של חלבון פלואורסצנטי מפוצל, המומלץ לחלבונים בעלי ביטוי נמוך במיוחד מכיוון שהוא משפר את מספר העותקים הפלואורסצנטיים לכל חלבון אנדוגני על ידי שימוש במספר עותקים פלואורסצנטיים מפוצלים¹⁰. בתחילה ניתן להעריך את מספר העותק בהתבסס על ערכות נתונים של תמלול מדף האינטרנט CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. בחירה של נוירון כדי לדמיין תחבורה אקסונלית
   1. בזן MTS1161, דמיינו את RAB-3 בתא העצב המוטורי DA9 (ראו איור 1). עבור מטענים אקסונליים אחרים, במיוחד חלבונים בעלי ביטוי נמוך, זהה נוירון שבו רמות הביטוי של החלבון המנותח הן הגבוהות ביותר באמצעות דף האינטרנט CenGen.
      הערה: פרויקט CenGen (cengen.org) מספק משאב מקוון נהדר להערכת רמות ביטוי עבור חלבון בעל עניין בתאי עצב רבים בנמטודה בהתבסס על מערך נתונים תעתיק גדול המכסה את כל 302 תאי העצב של מערכת העצבים C. elegans ^12,13.

2. טיפול בתולעים והכנה להדמיה

1. שמור נמטודות על מדשאה של חיידקים (זן: OP50) שנזרעו על לוחות בינוניים לגידול נמטודות ב -20 מעלות צלזיוס וגדלו עד גיל של יום אחד לתוך הבגרות לצורך הדמיה.
   הערה: מדידת הובלה אקסונלית בשלב גיל מוגדר חשובה מכיוון ששיעורי ההובלה יורדים עם ההזדקנות באופן עקבי על פני מטענים אקסונליים שונים, קבוצות נוירונים ואורגניזמים 14,15,16,17,18-נמטודות בשלב הזחל L4 או יום אחד לתוך הבגרות שימשו ברוב המאמרים ולכן מציעים את מערכי הנתונים הגדולים ביותר להשוואות.
2. הכנת נמטודות לדימות תאים חיים: בצע את כל השלבים הבאים עם מיקרוסקופ סטריאו כדי להמחיש את התולעים ולטפל בהן.
   1. מעבירים נמטודות לטיפה של 0.5 mM Levamisole באמצעות פיק חוט פלטינה ודוגרים על הנמטודות במשך 20 דקות בטיפת.
   2. הרכיבו בזהירות 10-20 נמטודות מטיפת הלבמיסול לתוך טיפה של 12 μL של מדיום M9 על מדבקה של 10% אגרוז (מומס בתווך M9) על מגלשת זכוכית באמצעות פיק שיער. לקבלת הליך מפורט על איך לעשות תיקון agarose 10%, עיין בפרוטוקול של S.Niwa⁷.
      הערה: הרכבה של מספר נמוך של נמטודות מספיקה מכיוון שרק בעלי חיים מעטים יצולמו בכל שקופית לפני שהחיות יתחילו לסבול מהיפוקסיה.
   3. הניחו את החלקת הכיסוי על גבי הטיפה (22 מ"מ x 22 מ"מ או 18 מ"מ x 18 מ"מ). להעברת הדמיה באקסון DA9, מקם את האקסון קרוב להחלקת הכיסוי. כדי לעשות זאת, סובבו את החלקת הכיסוי ב-45° לאחר הנחתה על גבי חלקת האגר, כדי לגלגל את החיות על גבן.
   4. אטמו את הרווח בין החלקת הכיסוי למגלשת הזכוכית בג'ל צמיגי כמו פטרולאטום. זה ימנע את התייבשות מדבקת האגרוז, מה שעלול לגרום לנמטודות להיסחף אל מחוץ לשדה ההדמיה.
      הערה: חשוב להתייחס לבעלי החיים בעדינות ככל האפשר. ריכוזים גבוהים מדי של לבמיזול או נזק פיזי לתולעת עלולים לפגוע בהובלה האקסונלית. עוויתות קלות של הזנב במהלך ההדמיה הן סימן טוב לכך שהחיה נשארת במצב בריא. בעלי חיים נשארים בריאים ואף יכולים להתאושש ממדבקת האגרוז לאחר ההדמיה.

3. מיקרוסקופ תאים חיים

הערה: ערכי פרמטרי רכישה מדויקים עשויים להיות שונים בין מיקרוסקופים. עם זאת, מגמות עבור כל פרמטר רכישה צריך להיות עצמאי המיקרוסקופ בשימוש. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי מסתובב שצויד בקו לייזר נפרד להלבנה (ראו טבלת חומרים לפרטים על המיקרוסקופ). פלואורסצנטיות ירוקה הורגשה על ידי לייזר 488 ננומטר והפליטה סוננה על ידי מסנן פליטה ET525/36. ההלבנה בוצעה באמצעות קו לייזר 488 ננומטר.

1. ודא כי הטמפרטורה של החדר, או אם שלב מבוקר טמפרטורה זמין, מוגדר לטמפרטורה קבועה. עבור נמטודות, הגדר את הטמפרטורה ל 20 °C (75 °F).
2. הרכיבו את המגלשה והשתמשו בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה של 4x-20x כדי לאתר את הנמטודות בשקופית ולשנן מיקומים. עבור לעדשת הגדלה של 63x לרכישת תמונה.
3. צלם תמונה אחת כדי לבדוק פרמטרים ראשוניים של רכישה. עקוב אחר עוצמות האות בשדה הראייה באמצעות היסטוגרמת העוצמה של תוכנת הרכישה. ערכי עוצמה צריכים לכסות את השליש התחתון של האות המרבי שהמצלמה יכולה לזהות. הימנע מרוויה של פיקסלים. שפר את עוצמת לייזר העירור אם עוצמת האות נמוכה מדי.
   הערה: אין להשתמש בעוצמות לייזר עירור גבוהות מדי מכיוון שהוא מלבין את החלבון הפלואורסצנטי במהלך חלוף זמן.
4. שנה את פרמטר הרכישה ואת השלבים כאן כדי למטב את זיהוי האות הפלואורסצנטי.
   1. יישום שלב הלבנה: אקונומיקה של אזור האקסון שעומד להיות מנותח באמצעות קו לייזר 488 ננומטר (הספק: 15 mW) עבור שלב ההלבנה. יש לשאוף ליעילות הלבנה של 90% לפחות. קבע את יעילות ההלבנה על ידי השוואת עוצמת האות של האזור לפני ואחרי שלב ההלבנה.
      הערה: הלבנה משפרת את האות של חלקיקים נעים על ידי הורדת האות הנובע מחלקיקים נייחים, כמו גם מהאות הנובע מהחלק הציטופלזמי של החלבון ברקע. למטען ממברנטי, כמו RAB-3 על מבשרי שלפוחית סינפטית, יש מקטע ציטופלזמי נמוך, כך ששלב ההלבנה משפר רק במעט את האות של חבילת ההובלה על הרקע הציטופלזמי (איור 2A,D). אולם הלבנה משפרת מעקב אחר אירועי הובלה בודדים על פני מרחקים ארוכים יותר ומאפשרת לכמת זמני השהיה (איור 2A).
   2. Binning: השתמש באיגוד 2 x 2 כדי לשפר את עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים. Binning משלב מערכי פיקסלים לפיקסל אחד גדול יותר. זה יפחית את הרזולוציה המרחבית אבל ישפר את עוצמת האות של אירועי הובלה בודדים, וזה מועיל במיוחד עבור חלקיקים עמומים (איור 2B,D).
   3. זמן חשיפה: שפר את זמן החשיפה כדי לשפר את עוצמת האות. שיפור זמן החשיפה משפר את עוצמת האות של הדגימה לעלות של קבלת רזולוציית זמן נמוכה יותר עבור אירועי ההובלה. לצורך הניסוי כאן, השתמש ברזולוציה זמנית של 300 מילישניות עד 700 מילישניות בין נקודות זמן רצופות (זמן חשיפה של 100-500 מילישניות) כדי לעקוב אחר אירועי הובלה בודדים של RAB-3. (איור 2C,D)
5. הקלטת קיטועי זמן: קח קיטוע זמן של לפחות 1-3 דקות בהתאם לעוצמת האות של החלבון, כמו גם לתדירות של אירועי הובלה בודדים. לאחר שנרשם פרק זמן עברו לחיה הבאה. אין לצלם בעלי חיים בשקופית במשך יותר מ-30 דקות כדי להבטיח שבעלי החיים המתועדים נמצאים במצב בריא.
   הערה: עוויתות קלות של זנב החיות במהלך ההקלטה הן אינדיקטור לכך שהחיה עדיין חיה.

4. ניתוח נתוני תעבורה אקסונליים

הערה: השתמש ב- ImageJ/Fiji¹⁹ לשלבי ניתוח התמונה הבאים. פיג'י מסוגלת לקרוא נתונים לפי כל חבילות התוכנה הנפוצות למיקרוסקופיה.

1. יצירת קימוגרף
   1. ייבוא נתונים: יבא את קובץ הנתונים עם קיטועי הזמן לפיג'י. במקרה שהוא לא יכול לייבא את הנתונים לפיג'י, ייצא את הקלטת הזמן כקובץ tiff מחבילת התוכנה וטען אותו לאחר מכן לפיג'י.
   2. תיקון סחף: בדוק אם מקטע החיה/אקסון זז או נסחף מעט במהלך רכישת התמונה. נכון לתנועת בעלי חיים או היסחפות על ידי הפעלת התוסף StackReg²⁰. בעת הפעלת התוסף, בחר את טרנספורמציית הגוף הנוקשה .
   3. יצירה ידנית של קימוגרף: הליך מפורט שלב אחר שלב מוצג באיור 3. השתמש בסרט תיקון הסחף כדי ליצור את הקימוגרף. השתמש בכלי קו מקוטע והתאם את רוחב הקו כך שיתאים לקוטר האקסון על-ידי לחיצה כפולה עם לחצן העכבר השמאלי על סמל הקו המקוטע כדי לצייר קו לאורך מקטע האקסון שינותח. הפעל את תוסף ImageJ/Fiji Kymoreslicewide כדי ליצור את הקימוגרף ולנצל את ערך העוצמה המרבית לרוחב הקו בהגדרות הפרמטרים שלו.
      הערה: שמירה על עקביות בכיוון ציור הקו (למשל, תמיד קרוב לאקסון דיסטלי או הפוך) מפשטת את כיוון התנועה לאחור בקימוגרפים.
2. ניתוח פרמטר התחבורה
   1. חשב את פרמטר התחבורה: מספר אירוע, מהירות, אורך ריצה ומשך השהיה מהקימוגרף על ידי ביצוע השלבים הבאים.
      1. עקוב אחר אירועי תעבורה בקימוגרף: השתמש בכלי קו ישר כדי לעקוב אחר אירועי תעבורה בודדים בקימוגרף. שמור כל שורה למנהל החזר ההשקעה ועקוב אחר כל אירועי התחבורה בקימוגרף. בחרו בפרמטרי המדידה הבאים ב- ImageJ/Fiji: שטח, מלבן תוחם, ערך אפור ממוצע, קוטר Feret.
      2. חישוב פרמטר תעבורה: הדבק את טבלת התוצאות בגיליון אלקטרוני והשתמש בעמודות הבאות של מקטעי התוצאות כדי לחשב:
         אורך הפעלה: הכפל את הרוחב (בפיקסל) ברזולוציה של המצלמה (לדוגמה, x μm/pxl) כדי לקבוע את אורך ההפעלה במיקרומטר.
         מהירות: אורך הריצה/משך הריצה. כדי לקבוע את משך הזמן של אירוע תנועה בשניות, הכפל גובה (בפיקסל) בזמן הרכישה בין נקודות זמן עוקבות (לדוגמה, x s/pixel).
         זמן השהיה: משך הריצה בין שתי תנועות רצופות שבהן המהירות היא 0.
         מספר אירוע: ניתן לנרמל את סך האירועים לאורך הכולל של הקימוגרף כדי לקבוע את מספר האירוע לדקה ואת מקטע אורך האקסון (axon length). ניתן לסווג אירועים נוספים לאירועי תחבורה אנטרוגרדיים ונסוגים. כדי לקבוע את הכיווניות של כל אירוע תנועתי, השתמש בכלי זווית Feret. בקימוגרפים שנוצרו בתחילה על ידי שרטוט הקו המקוטע מפרוקסימלי לדיסטלי ואירועי ההובלה האנטרוגרדית בקימוגרף מצביעים מימין לשמאל, זווית פרט < 90° תצביע על אנטרוגרד ו->90° אירוע נסוג, אחרת זה יהיה הפוך.

תוצאות

סקירה כללית של מערכת המודל והליך המדידה
כדי להמחיש הובלה אקסונלית של מבשרי שלפוחית סינפטית, עקבנו אחר GFP אנדוגני שכותרתו RAB-3. כאן אנו עושים שימוש בזן GFP שנוצר לאחרונה::Flip-on::RAB-3 זן⁶, שבו ביטוי של רקומבינאז פליפאז תחת מקדם ספציפי לתא (glr-4p) מתייג RAB-3...

Discussion

מגבלות השיטה והשיטות החלופיות
בפרוטוקול זה, ביצענו אופטימיזציה של פרמטרי רכישה כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של RAB-3 המתויג אנדוגנית, המשויכת למבשרי שלפוחית סינפטית. כדי להמחיש את RAB-3, השתמשנו ב-FLIP-on::GFP::RAB-3 זן⁶ שפורסם לאחרונה וביטאנו את הרקומבינאז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)