通过荧光显微镜优化活体秀丽隐杆线虫中内源性货物轴突运输的可视化

摘要

该论文描述了荧光显微镜采集参数的优化，以可视化活线虫中内源性标记货物在单神经元分辨率下的轴突运输。

摘要

轴突运输是将轴突蛋白从神经元细胞体内的合成位点递送到轴突中的目的地的先决条件。因此，轴突运输的丢失会损害神经元的生长和功能。因此，研究轴突运输可以提高我们对神经元细胞生物学的理解。随着 CRISPR Cas9 基因组编辑的最新改进，轴突货物的内源性标记已经变得触手可及，从而能够超越基于异位表达的运输可视化。然而，内源性标记通常以低信号强度为代价，并且需要优化策略来获得可靠的数据。在这里，我们描述了一种通过讨论采集参数和漂白方法来优化轴突运输可视化的方案，以改善弥漫细胞质背景上内源性标记货物的信号。我们应用我们的方案来优化由绿色荧光蛋白 （GFP） 标记的 RAB-3 标记的突触小泡前体 （SVP） 的可视化，以强调微调采集参数如何改善 秀丽隐杆线虫 （C. elegans） 中内源性标记轴突货物的分析。

引言

在整个生命中，神经元依靠轴突运输将蛋白质、脂质和其他分子从细胞体输送到它们在轴突中的最终目的地。因此，轴突运输受损与神经元功能丧失有关，并且通常与神经退^{行性疾病的}病理学有关^1,2。因此，了解轴突运输的基础机制非常有趣。

几十年来对轴突运输的研究揭示了对介导这种运输的分子机制、它们的组成以及调节机制的许多重要见解。长距离轴突运输发生在微管细胞骨架上，微管细胞骨架由部分重叠的微管聚合物组成，这些微管聚合物通常在轴突中以正端为导向³。因此，顺行运输是由运动蛋白介导的，这些运动蛋白走到微管的正端，即驱动蛋白，而逆行运输取决于负端定向动力蛋白运动。尽管已经揭示了运输的许多方面，但对于许多轴突蛋白，它们如何被装载到运输机械中，各个运输包裹是如何组织的，以及这种运输是如何调节的，仍然不清楚³。

轴突运输最初是在放射性标记实验中研究的，其中放射性标记的氨基酸被注射到体细胞区室中，在那里它们被掺入新生的内源性蛋白质中，并且可以通过放射自显影在轴突区室中随着时间的推移进行追踪⁴。尽管放射性标记实验允许研究体内内 源性蛋白质的轴突转运，但它不允许直接跟踪单个货物的行为以获得机制见解⁴。使用荧光显微镜克服了这一限制。然而，轴突转运通常不是在内源性蛋白质上可视化的，而是通过荧光标记拷贝的表达来实现的。特别是对于低表达蛋白质，过表达提供了更高的信号强度，这使得可视化成为可能，最好是具有单个神经元分辨率。此外，荧光标记蛋白的异位表达规避了基因组编辑的需求和挑战。相反，有人认为异位表达的货物的行为可能与内源性货物的行为不同⁵。

基因组编辑的最新改进使内源性标记策略更容易获得。因此，较低的信号强度已成为通过异位表达而不是内源性标记来研究货物轴突运输的主要限制。仔细考虑内源性标记策略并优化采集条件可以克服这一挑战。

线虫为研究 体内 轴突运输提供了一个很好的研究模型，因为它们具有透明度和易于遗传操作。在该协议中，我们描述了一种研究策略，以可视化活秀 丽隐杆线虫 中具有单神经元分辨率的内源性蛋白质的轴突转运。我们使用 Jorgensen 实验室⁶ 产生的菌株可视化突触小泡前体的轴突转运，其中囊泡相关的 RAB GTP 酶 RAB3 在运动神经元 DA9 中用 GFP 内源性标记。通过询问不同采集参数和光漂白的微小适应如何改善单个传输事件的可视化，该协议提供了有关如何优化成像条件的想法。

研究方案

有关如何维护和准备用于活细胞成像的线虫的详细方案，请参阅 S.Niwa ⁷ 的工作。

1. 蠕虫菌株产生

除了生成线虫菌株外，Caenorhabditis 遗传学中心 （CGC）⁸ 还包含越来越多的线虫菌株，这些线虫菌株具有内源性荧光标记的蛋白质，可以直接从其网页获得。

1. 荧光标记策略的选择
   1. 使用含有 rab-3（ox699） 等位基因⁶ 的线虫菌株MTS1161在 DA9 运动神经元中可视化内源性 GFP 标记的 RAB-3（菌株将沉积在 CGC 处）。为了可视化其他轴突蛋白，使用 Mello Lab⁹ 的 CRISPR Cas9 编辑方案生成具有内源性标记蛋白的线虫菌株 9.
      注:MTS1161利用重组方法用 GFP 标签⁶ 特异性地标记 RAB-3 内源性。一种常见的替代方法是基于分裂荧光蛋白的重构，建议用于特别低表达的蛋白质，因为它通过使用多个分裂荧光拷贝来增加每个内源性蛋白的荧光拷贝数¹⁰。拷贝数最初可以根据 CenGen 网页 （https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/） ¹¹ 中的转录组数据集进行估计。
2. 选择神经元来可视化轴突运输
   1. 在菌株MTS1161中，可视化运动神经元 DA9 中的 RAB-3（参见 图 1）。对于其他轴突货物，尤其是低表达蛋白质，使用 CenGen 网页确定分析蛋白质表达水平最高的神经元。
      注:CenGen 项目 （cengen.org） 提供了一个很好的在线资源，可以根据涵盖秀丽隐杆线虫神经系统所有 302 个神经元的大型转录组数据集来估计线虫许多神经元中感兴趣蛋白质的表达水平^12,13。

2. 蠕虫处理和成像准备

1. 将线虫维持在线虫生长培养基平板上的细菌（菌株:OP50）草坪上，并在20°C下生长至1日龄至成年期进行成像。
   注意:在确定的年龄阶段测量轴突运输很重要，因为运输速率随着不同轴突货物、神经元类别和生物体的衰老而持续下降 14,15,16,17,18-线虫在幼虫阶段 L4 或成年后 1 天已被用于大多数论文，因此提供了最大的数据集进行比较。
2. 准备用于活细胞成像的线虫:使用立体显微镜执行所有后续步骤，以观察和处理蠕虫。
   1. 使用铂丝镐将线虫转移到 0.5 mM 左旋咪唑的液滴中，并将线虫在液滴中孵育 20 分钟。
   2. 使用发镐将左旋咪唑液滴中的 10-20 条线虫小心地封印在载玻片上的 10% 琼脂糖（溶于 M9 培养基）贴片上的 12 μL M9 培养基液滴中。有关如何制备 10% 琼脂糖贴剂的详细程序，请参阅 S.Niwa⁷ 的方案。
      注意:安装少量线虫就足够了，因为在动物开始缺氧之前，每张载玻片只会对少数动物进行成像。
   3. 将盖玻片放在液滴顶部（22 mm x 22 mm 或 18 mm x 18 mm）。为了在 DA9 轴突中成像运输，将轴突放置在靠近盖玻片的位置。为此，将盖玻片放在琼脂贴顶部后将盖玻片旋转 45°，以将动物卷到背上。
   4. 用粘性凝胶（如凡士林）密封盖玻片和载玻片之间的空间。这将防止琼脂糖贴片干燥，这会导致线虫漂出成像视野。
      注意:尽可能温柔地对待动物至关重要。过高浓度的左旋咪唑或对蠕虫的物理损伤会损害轴突运输。在成像过程中尾巴的轻微抽搐是动物保持健康状态的好兆头。动物保持健康，甚至可以在成像后从琼脂糖斑片中恢复。

3. 活细胞显微镜

注意:显微镜之间的确切采集参数值可能不同。但是，每个采集参数的趋势应与所使用的显微镜无关。在该方案中使用了配备有单独激光线用于漂白的旋转盘共聚焦显微镜（有关显微镜的详细信息，请参见 材料表 ）。绿色荧光由 488 nm 激光激发，发射由 ET525/36 发射滤光片过滤。使用 488 nm 激光线进行漂白。

1. 确保房间的温度或温控舞台（如果有）设置为恒定温度。对于线虫，将温度设置为 20 °C。
2. 安装载玻片并使用放大倍数为 4x-20 倍的物镜定位载玻片上的线虫并记住位置。切换到 63 倍放大倍率镜头进行图像采集。
3. 拍摄单张图像以检查初始采集参数。使用采集软件的强度直方图跟踪视野中的信号强度。强度值应覆盖摄像机可以检测到的最大信号的最低三分之一。避免像素饱和。如果信号强度太低，请增强激发激光的强度。
   注意:不要使用太高的激发激光强度，因为它会在延时过程中漂白荧光蛋白。
4. 在此处更改采集参数和步骤以优化荧光信号检测。
   1. 实施漂白步骤:使用 488 nm 激光（功率:15 mW）线漂白要分析的轴突区域进行漂白步骤。目标是至少 90% 的漂白效率。通过比较漂白步骤前后区域的信号强度来确定漂白效率。
      注:漂白通过降低来自静止颗粒的信号以及来自背景中蛋白质的细胞质部分的信号来增强移动颗粒的信号。膜货物，例如突触小泡前体上的 RAB-3 具有较低的细胞质分数，因此漂白步骤仅温和地改善了细胞质背景上运输包的信号（图 2A，D）。然而，漂白改进了对较长距离的单个运输事件的追踪，并允许量化暂停时间（图 2A）。
   2. 像素合并:使用 2 x 2 像素合并来增强单个走带控制事件的信号强度。像素合并将像素数组合并为一个较大的像素。这将降低空间分辨率，但增强单个传输事件的信号强度，并且对暗淡的粒子特别有用（图 2B、D）。
   3. 曝光时间:增强曝光时间以增强信号强度。增强曝光时间会增加样本的信号强度，从而为传输事件获得较低的时间分辨率。对于这里的实验，在连续时间点（100-500 毫秒曝光时间）之间使用 300 毫秒到 700 毫秒的时间分辨率来跟踪 RAB-3 的单个运输事件。（图 2C，D）
5. 延时记录:根据蛋白质的信号强度以及单个运输事件的频率，至少进行 1-3 分钟的延时摄影。记录到延时后，移动到下一只动物。载玻片上的动物成像时间不应超过 30 分钟，以确保记录的动物处于健康状态。
   注意:在录制过程中，动物尾巴的轻微抽搐表明动物还活着。

4. 分析轴突传输数据

注意:使用 ImageJ/Fiji¹⁹ 进行后续图像分析步骤。斐济能够通过所有常见的显微镜软件包读取数据。

1. Kymograph 生成
   1. Import data（导入数据）:将延时数据文件导入 Fiji。如果无法将数据导入斐济，请从软件包中将时间记录导出为 tiff 文件，然后加载到斐济。
   2. 漂移校正:检查动物/轴突段在图像采集过程中是否移动或轻微漂移。通过运行插件 StackReg²⁰ 来纠正动物移动或漂移。运行插件时，选择 Rigid Body （刚体 ） 变换。
   3. 手动生成运动记录仪: 图 3 提供了详细的分步过程。利用漂移校正电影生成运动图。使用分割线工具，通过在分割线图标上双击鼠标左键来调整线宽以匹配轴突直径，以沿将要分析的轴突段绘制一条线。运行 ImageJ/Fiji 插件 Kymoreslicewide 以生成 kymograph 并在其参数设置中使用整个线宽的最大强度值。
      注意:保持画线方向的一致性（例如，始终靠近远端轴突或反向）简化了运动记录仪中向后移动方向的追踪。
2. 传输参数分析
   1. 按照后续步骤，从 kymograph 计算传输参数:事件编号、速度、运行长度和暂停持续时间。
      1. 在 Kymograph 中跟踪传输事件:使用 Straight Line 工具跟踪 Kymograph 上的单个传输事件。将每条线保存到 ROI 管理器中，并跟踪 kymograph 中的所有传输事件。在 ImageJ/Fiji 中选择以下测量参数:面积、边界矩形、平均灰度值、费雷特直径。
      2. 计算传输参数:将结果表粘贴到电子表格中，并使用结果部分的以下列进行计算:
         运行长度:将宽度（以像素为单位）乘以相机的分辨率（例如，x μm/pxl）以确定以 μm 为单位的运行长度。
         Velocity:运行长度/运行持续时间。要确定移动事件的持续时间（以秒为单位），请将高度（以像素为单位）乘以连续时间点之间的采集时间（例如，x s/像素）。
         暂停时间:在速度为 0 的两个连续动作之间运行持续时间。
         事件编号:事件总数可以标准化为运动量计的总长度，以确定每分钟的事件数和轴突长度段。事件可进一步分为顺行和逆行运输事件。要确定每个移动事件的方向性，请使用 Feret Angle 工具。在最初通过绘制从近端到远端的分段线生成的运动记录仪中，运动记录仪中的顺行运输事件是从右向左指向的，90° 的费雷特角<表示顺行，>90° 表示逆行事件，否则相反。

结果

模型系统和测量程序概述
为了可视化突触小泡前体的轴突转运，我们追踪了内源性 GFP 标记的 RAB-3。在这里，我们利用了最近生成的 GFP::Flip-on::RAB-3 菌株⁶，其中重组酶 Flippase 在细胞特异性启动子 （glr-4p） 下的表达标记了 DA9 运动神经元中的内源性 RAB-3。DA9 是一种双极运动神经元，其细胞体位于动物腹侧的后部，靠近肛门（

讨论

方法和替代方法的局限性
在该协议中，我们优化了采集参数以可视化内源性标记的 RAB-3 的轴突转运，它与突触小泡前体相关。为了可视化 RAB-3，我们利用了最近发表的 FLIP-on::GFP::RAB-3 菌株⁶，并在细胞特异性启动子 （glr-4p） 下表达重组酶 Flippase25。这种策略允许我们用单个 GFP 荧光团标记 RAB-3。RAB-3 相对容易可视化，因?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)