通过荧光显微镜优化活体秀丽隐杆线虫中内源性货物轴突运输的可视化

摘要

该论文描述了荧光显微镜采集参数的优化，以可视化活线虫中内源性标记货物在单神经元分辨率下的轴突运输。

摘要

轴突运输是将轴突蛋白从神经元细胞体内的合成位点递送到轴突中的目的地的先决条件。因此，轴突运输的丢失会损害神经元的生长和功能。因此，研究轴突运输可以提高我们对神经元细胞生物学的理解。随着 CRISPR Cas9 基因组编辑的最新改进，轴突货物的内源性标记已经变得触手可及，从而能够超越基于异位表达的运输可视化。然而，内源性标记通常以低信号强度为代价，并且需要优化策略来获得可靠的数据。在这里，我们描述了一种通过讨论采集参数和漂白方法来优化轴突运输可视化的方案，以改善弥漫细胞质背景上内源性标记货物的信号。我们应用我们的方案来优化由绿色荧光蛋白 （GFP） 标记的 RAB-3 标记的突触小泡前体 （SVP） 的可视化，以强调微调采集参数如何改善 秀丽隐杆线虫 （C. elegans） 中内源性标记轴突货物的分析。

引言

在整个生命中，神经元依靠轴突运输将蛋白质、脂质和其他分子从细胞体输送到它们在轴突中的最终目的地。因此，轴突运输受损与神经元功能丧失有关，并且通常与神经退^{行性疾病的}病理学有关^1,2。因此，了解轴突运输的基础机制非常有趣。

几十年来对轴突运输的研究揭示了对介导这种运输的分子机制、它们的组成以及调节机制的许多重要见解。长距离轴突运输发生在微管细胞骨架上，微管细胞骨架由部分重叠的微管聚合物组成，这些微管聚合物通常在轴突中以正端为导向³。因此，顺行运输是由运动蛋白介导的，这些运动蛋白走到微管的正端，即驱动蛋白，而逆行运输取决于负端定向动力蛋白运动。尽管已经揭示了运输的许多方面，但对于许多轴突蛋白，它们如何被装载到运输机械中，各个运输包裹是如何组织的，以及这种运输是如何调节的，仍然不清楚³。

轴突运输最初是在放射性标记实验中研究的，其中放射性标记的氨基酸被注射到体细胞区室中，在那里它们被掺入新生的内源性蛋白质中，并且可以通过放射自显影在轴突区室中随着时间的推移进行追踪⁴。尽管放射性标记实验允许研究体内内 <....

研究方案

有关如何维护和准备用于活细胞成像的线虫的详细方案，请参阅 S.Niwa ⁷ 的工作。

1. 蠕虫菌株产生

除了生成线虫菌株外，Caenorhabditis 遗传学中心 （CGC）⁸ 还包含越来越多的线虫菌株，这些线虫菌株具有内源性荧光标记的蛋白质，可以直接从其网页获得。

1. 荧光标记策略的选择
   1. 使用含有 rab-3（ox699） 等位基因⁶ 的线虫菌株MTS1161在 DA9 运动神经元中可视化内源性 GFP 标记的 RAB-3（菌株将沉积在 CGC 处）。为了可视化其他轴突蛋白，使用 Mello Lab⁹ 的 CRISPR Cas9 编辑方案生成具有内源性标记蛋白的线虫菌株 9.
      注：MTS1161利用重组方法用 GFP 标签⁶ 特异性地标记 RAB-3 内源性。一种常见的替代方法是基于分裂荧光蛋白的重构，建议用于特别低表达的蛋白质，因为它通过使用多个分裂荧光拷贝来增加每个内源性蛋白的荧光拷贝数¹⁰。....

讨论

方法和替代方法的局限性
在该协议中，我们优化了采集参数以可视化内源性标记的 RAB-3 的轴突转运，它与突触小泡前体相关。为了可视化 RAB-3，我们利用了最近发表的 FLIP-on：：GFP：：RAB-3 菌株⁶，并在细胞特异性启动子 （glr-4p） 下表达重组酶 Flippase25。这种策略允许我们用单个 GFP 荧光团标记 RAB-3。RAB-3 相对容易可视?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)