Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

Resumen

El artículo describe la optimización de los parámetros de adquisición de microscopía de fluorescencia para visualizar el transporte axonal de cargas endógenas marcadas con una resolución de una sola neurona en un nematodo vivo.

Resumen

El transporte axonal es un requisito previo para entregar proteínas axonales desde su sitio de síntesis en el cuerpo de la célula neuronal hasta su destino en el axón. En consecuencia, la pérdida de transporte axonal perjudica el crecimiento y la función neuronal. Por lo tanto, el estudio del transporte axonal mejora nuestra comprensión de la biología celular neuronal. Con las recientes mejoras en la edición del genoma de CRISPR Cas9, el etiquetado endógeno de las cargas axonales se ha vuelto accesible, lo que permite ir más allá de la visualización del transporte basada en la expresión ectópica. Sin embargo, el etiquetado endógeno a menudo se produce a costa de una señal de baja intensidad y requiere estrategias de optimización para obtener datos sólidos. Aquí, describimos un protocolo para optimizar la visualización del transporte axonal mediante la discusión de los parámetros de adquisición y un enfoque de blanqueo para mejorar la señal de la carga endógena marcada sobre un fondo citoplasmático difuso. Aplicamos nuestro protocolo para optimizar la visualización de los precursores de vesículas sinápticas (SVP) marcados por RAB-3 marcado con proteína fluorescente verde (GFP) para resaltar cómo el ajuste fino de los parámetros de adquisición puede mejorar el análisis de la carga axonal marcada endógenamente en Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introducción

A lo largo de la vida, las neuronas dependen del transporte axonal para transportar proteínas, lípidos y otras moléculas desde el cuerpo celular hasta su destino final en el axón. En consecuencia, la alteración del transporte axonal se asocia con una pérdida de la función neuronal y a menudo está involucrada en la patología de trastornos neurodegenerativos ^1,2. Por lo tanto, es de gran interés comprender los mecanismos que subyacen al transporte axonal.

Varias décadas de investigación sobre el transporte axonal revelaron muchos conocimientos importantes sobre la maquinaria molecular que media este transporte, su composición y los mecanismos reguladores. El transporte axonal de largo alcance ocurre en el citoesqueleto de los microtúbulos, que consiste en polímeros de microtúbulos parcialmente superpuestos que generalmente están orientados con su extremo positivo hacia afuera en los axones³. En consecuencia, el transporte anterógrado está mediado por proteínas motoras que caminan hacia el extremo positivo de los microtúbulos, las quinesinas, mientras que el transporte retrógrado depende del motor de dineína dirigido al extremo negativo. Aunque se han revelado muchos aspectos del transporte, para muchas proteínas axonales todavía no está claro cómo se cargan en la maquinaria de transporte, cómo se organizan los paquetes de transporte individuales y cómo se regula este transporte³.

El transporte axonal se estudió inicialmente en experimentos de radiomarcaje, en los que se inyectaron aminoácidos radiomarcados en el compartimento somático, donde se incorporaron a las proteínas endógenas nacientes y se pudieron rastrear a lo largo del tiempo en el compartimento axonal mediante autorradiografía⁴. Aunque los experimentos de radiomarcaje permitieron el estudio del transporte axonal de proteínas endógenas in vivo, no permiten el seguimiento directo del comportamiento de la carga individual para obtener información mecanicista⁴. Esta limitación se superó con el uso de la microscopía de fluorescencia. Sin embargo, el transporte axonal a menudo no se visualiza en las proteínas endógenas, sino por la expresión de una copia marcada con fluorescencia. Especialmente para proteínas de baja expresión, la sobreexpresión proporciona intensidades de señal más altas que hacen posible la visualización, preferiblemente con resolución de una sola neurona. Además, la expresión ectópica de la proteína marcada con fluorescencia evita la necesidad y los desafíos de la edición del genoma. Por el contrario, se ha argumentado que el comportamiento de la carga expresada ectópicamente puede diferir del comportamiento de la carga endógena⁵.

Las mejoras recientes en la edición del genoma facilitaron el acceso a las estrategias de etiquetado endógeno. Por lo tanto, una intensidad de señal más baja se ha convertido en la principal limitación para estudiar el transporte axonal de una carga por expresión ectópica en lugar de marcaje endógeno. Las consideraciones cuidadosas en la estrategia de etiquetado endógeno, junto con una optimización de las condiciones de adquisición, pueden superar este desafío.

Los nematodos proporcionan un excelente modelo de investigación para estudiar el transporte axonal in vivo debido a su transparencia y facilidad en las manipulaciones genéticas. En este protocolo, describimos una estrategia de investigación para visualizar el transporte axonal de proteínas endógenas con resolución de una sola neurona en Caenorhabditis elegans vivos. Visualizamos el transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas mediante el uso de una cepa generada por el Jorgensen Lab⁶, en la que la vesícula asociada a RAB GTPasa, RAB3, está marcada endógenamente con GFP, en la neurona motora DA9. Al preguntarse cómo las pequeñas adaptaciones en diferentes parámetros de adquisición y el fotoblanqueo pueden mejorar la visualización de eventos de transporte individuales, el protocolo proporciona ideas sobre cómo optimizar las condiciones de imagen.

Protocolo

Para obtener un protocolo detallado sobre cómo mantener y preparar nematodos para la obtención de imágenes de células vivas, consulte el trabajo de S.Niwa ⁷.

1. Generación de cepas de gusanos

Además de generar cepas de nematodos, el Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)⁸ contiene una creciente colección de cepas de nematodos con proteínas marcadas con fluorescencia endógena que se pueden obtener directamente desde su página web.

1. Elección de la estrategia de marcaje con fluorescencia
   1. Utilice la cepa de nematodos MTS1161, que contiene el alelo⁶ de rab-3(ox699), para visualizar la GFP endógena marcada con RAB-3 en la neurona motora DA9 (la cepa se depositará en el CGC). Para visualizar otras proteínas axonales, genere una cepa de nematodos con una proteína endógena marcada utilizando el protocolo de edición CRISPR Cas9 del Mello Lab⁹.
      NOTA: MTS1161 utiliza un enfoque de recombinación para etiquetar específicamente la célula RAB-3 de forma endógena con una etiqueta GFP⁶. Un enfoque alternativo común se basa en la reconstitución de una proteína fluorescente dividida, que se recomienda para proteínas de expresión especialmente baja, ya que aumenta el número de copias fluorescentes por proteína endógena mediante el uso de múltiples copias fluorescentes divididas¹⁰. El número de copias puede estimarse inicialmente a partir de los conjuntos de datos de transcriptomas de la página web de CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Elección de la neurona para visualizar el transporte axonal
   1. En la MTS1161 de tensión, visualice RAB-3 en la neurona motora DA9 (ver Figura 1). Para otras cargas axonales, especialmente proteínas de baja expresión, identifique una neurona en la que los niveles de expresión de la proteína analizada sean más altos utilizando la página web de CenGen.
      NOTA: El proyecto CenGen (cengen.org) proporciona un excelente recurso en línea para estimar los niveles de expresión de una proteína de interés en muchas neuronas del nematodo basado en un gran conjunto de datos transcriptómicos que cubren las 302 neuronas del sistema nervioso de C. elegans ^12,13.

2. Manipulación de gusanos y preparación para la obtención de imágenes

1. Mantenga los nematodos en un césped de bacterias (cepa: OP50) sembrados en placas de medio de crecimiento de nematodos a 20 °C y cultivados hasta una edad de 1 día hasta la edad adulta para la toma de imágenes.
   NOTA: La medición del transporte axonal en una etapa de edad definida es importante ya que las tasas de transporte disminuyen con el envejecimiento de manera constante en diferentes cargas axonales, clases de neuronas y organismos. 14,15,16,17,18-Nematodos^en la etapa larvaria L4 o 1 día en la edad adulta se han utilizado en la mayoría de los artículos y, por lo tanto, ofrecen los conjuntos de datos más grandes para las comparaciones.
2. Preparación de nematodos para la obtención de imágenes de células vivas: Realice todos los pasos posteriores con un microscopio estereoscópico para visualizar y manipular los gusanos.
   1. Transfiera los nematodos a una gota de 0,5 mM de Levamisol utilizando un pico de alambre de platino e incube los nematodos durante 20 minutos en la gota.
   2. Monte con cuidado 10-20 nematodos de la gota de levamisol en una gota de 12 μL de medio M9 en un parche de agarosa al 10% (disuelto en medio M9) en un portaobjetos de vidrio usando un palillo para el cabello. Para obtener un procedimiento detallado sobre cómo hacer un parche de agarosa al 10%, consulte el protocolo de S.Niwa⁷.
      NOTA: Montar un número bajo de nematodos es suficiente, ya que solo se tomarán imágenes de unos pocos animales por portaobjetos antes de que los animales comiencen a sufrir hipoxia.
   3. Coloque un cubreobjetos encima de la gota (22 mm x 22 mm o 18 mm x 18 mm). Para el transporte de imágenes en el axón DA9, coloque el axón cerca del cubreobjetos. Para ello, gire el cubreobjetos 45° después de colocarlo sobre el parche de agar, para hacer rodar a los animales sobre su espalda.
   4. Selle el espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos de vidrio con un gel viscoso como la vaselina. Esto evitará que el parche de agarosa se seque, lo que puede hacer que los nematodos se desplacen fuera del campo de imágenes.
      NOTA: Es crucial tratar a los animales con la mayor delicadeza posible. Concentraciones demasiado altas de levamisol o daños físicos en el gusano pueden afectar el transporte axonal. Los espasmos leves de la cola durante la sesión de imágenes son una buena señal de que el animal permanece en un estado saludable. Los animales se mantienen sanos e incluso pueden recuperarse del parche de agarosa después de la sesión de imagen.

3. Microscopía de células vivas

NOTA: Los valores exactos de los parámetros de adquisición pueden diferir entre los microscopios. Sin embargo, las tendencias de cada parámetro de adquisición deben ser independientes del microscopio utilizado. En este protocolo se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio que estaba equipado con una línea láser separada para el blanqueo (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el microscopio). La fluorescencia verde fue excitada por un láser de 488 nm y la emisión fue filtrada por un filtro de emisión ET525/36. El blanqueo se realizó utilizando una línea láser de 488 nm.

1. Asegúrese de que la temperatura de la habitación, o si se dispone de una etapa con control de temperatura, esté ajustada a una temperatura constante. Para los nematodos, ajuste la temperatura a 20 °C.
2. Monte el portaobjetos y use la lente del objetivo con un aumento de 4x-20x para ubicar los nematodos en el portaobjetos y memorizar las posiciones. Cambie a una lente de aumento de 63x para la adquisición de imágenes.
3. Tome una sola imagen para comprobar los parámetros de adquisición iniciales. Realice un seguimiento de las intensidades de la señal en el campo de visión con el histograma de intensidad del software de adquisición. Los valores de intensidad deben cubrir el tercio más bajo de la señal máxima que la cámara puede detectar. Evite la saturación de píxeles. Mejore la intensidad del láser de excitación si la intensidad de la señal es demasiado baja.
   NOTA: No utilice intensidades de láser de excitación demasiado altas, ya que blanquea la proteína fluorescente durante el lapso de tiempo.
4. Modifique el parámetro de adquisición y los pasos aquí para optimizar la detección de la señal de fluorescencia.
   1. Implementación de una etapa de blanqueo: Blanquear la región del axón que se va a analizar utilizando una línea láser de 488 nm (potencia: 15 mW) para la etapa de blanqueo. Apunta a una eficiencia de blanqueo de al menos el 90%. Determine la eficiencia del blanqueo comparando la intensidad de la señal de la región antes y después del paso de blanqueo.
      NOTA: El blanqueo mejora la señal de las partículas en movimiento al reducir la señal que se deriva de las partículas estacionarias, así como la señal que se deriva de la fracción citoplasmática de la proteína en el fondo. La carga membranosa, como RAB-3 en los precursores de vesículas sinápticas, tiene una fracción citoplasmática baja, por lo que la etapa de blanqueo solo mejora ligeramente la señal del paquete de transporte sobre el fondo citoplasmático (Figura 2A, D). Sin embargo, el blanqueo mejora el seguimiento de los eventos de transporte individuales en distancias más largas y permite cuantificar los tiempos de pausa (Figura 2A).
   2. Agrupación: utilice la agrupación en bins 2 x 2 para mejorar la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales. La agrupación combina matrices de píxeles en un píxel más grande. Esto reducirá la resolución espacial, pero mejorará la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales y es especialmente útil para partículas tenues (Figura 2B, D).
   3. Tiempo de exposición: Mejore el tiempo de exposición para mejorar la intensidad de la señal. La mejora del tiempo de exposición aumenta la intensidad de la señal de la muestra a costa de obtener una resolución temporal más baja para los eventos de transporte. Para el experimento aquí, use una resolución temporal de 300 ms a 700 ms entre puntos de tiempo consecutivos (tiempo de exposición de 100 a 500 ms) para seguir los eventos de transporte individuales de RAB-3. (Figura 2C,D)
5. Registro de lapso de tiempo: Realice un lapso de tiempo de al menos 1-3 minutos dependiendo de la intensidad de la señal de la proteína, así como de la frecuencia de los eventos de transporte individuales. Una vez que se haya registrado un lapso de tiempo, pase al siguiente animal. No se deben tomar imágenes de los animales en un portaobjetos durante más de 30 minutos para garantizar que los animales registrados estén en un estado saludable.
   NOTA: Los movimientos leves de la cola de los animales durante la grabación son un indicador de que el animal todavía está vivo.

4. Análisis de los datos de transporte axonal

NOTA: Utilice ImageJ/Fiji¹⁹ para los siguientes pasos de análisis de imágenes. Fiji es capaz de leer datos mediante todos los paquetes de software de microscopía comunes.

1. Generación de Kymograph
   1. Importar datos: Importe el archivo de datos de lapso de tiempo a Fiji. En caso de que no pueda importar los datos a Fiji, exporte el registro de tiempo como un archivo tiff desde el paquete de software y cárguelo posteriormente en Fiji.
   2. Corrección de deriva: Compruebe si el segmento animal/axón se ha movido o se ha desviado ligeramente durante la adquisición de la imagen. Corrija el movimiento de los animales o la deriva ejecutando el complemento StackReg²⁰. Al ejecutar el complemento, elija la transformación Cuerpo rígido .
   3. Generación manual de un kymograph: En la Figura 3 se proporciona un procedimiento detallado paso a paso. Utilice la película corregida de deriva para generar el quimógrafo. Utilice la herramienta Línea segmentada y ajuste el ancho de la línea para que coincida con el diámetro del axón haciendo doble clic con el botón izquierdo del ratón en el icono de línea segmentada para dibujar una línea a lo largo del segmento del axón que se analizará. Ejecute el complemento Kymoreslicewide de ImageJ/Fiji para generar el kymograph y utilice el valor de intensidad máxima a lo ancho de la línea en su configuración de parámetros.
      NOTA: Mantener la consistencia en la dirección del dibujo lineal (por ejemplo, siempre proximal al axón distal o inverso) simplifica el trazado de la dirección del movimiento hacia atrás en los quimógrafos.
2. Análisis de los parámetros de transporte
   1. Calcule el parámetro de transporte: número de evento, velocidad, duración de la ejecución y duración de la pausa del kymograph siguiendo los pasos siguientes.
      1. Rastrear eventos de transporte en el quimógrafo: Utilice la herramienta Línea recta para trazar eventos de transporte individuales en el quimógrafo. Guarde cada línea en el administrador de ROI y rastree todos los eventos de transporte en el kymograph. Elija los siguientes parámetros de medición en ImageJ/Fiji: Área, Rectángulo delimitador, Valor medio de gris, Diámetro de Feret.
      2. Calcular parámetro de transporte: pegue la tabla de resultados en una hoja de cálculo y utilice las siguientes columnas de las secciones de resultados para calcular:
         Longitud de la tirada: Multiplique la anchura (en píxeles) por la resolución de la cámara (por ejemplo, x μm/pxl) para determinar la longitud de la tirada en μm.
         Velocidad: Longitud de la carrera/Duración de la ejecución. Para determinar la duración de un evento de movimiento en segundos, multiplique la altura (en píxeles) por el tiempo de adquisición entre puntos de tiempo consecutivos (por ejemplo, x s/píxel).
         Tiempo de pausa: duración de la carrera entre dos movimientos consecutivos a los que la velocidad es 0.
         Número de evento: Los eventos totales se pueden normalizar a la longitud total del quimógrafo para determinar el número de eventos por minuto y el segmento de longitud del axón. Los eventos se pueden clasificar a su vez en eventos de transporte anterógrados y retrógrados. Para determinar la direccionalidad de cada evento de movimiento, utilice la herramienta Ángulo de Feret. En los cimogramas que se generaron inicialmente dibujando la línea segmentada de proximal a distal y los eventos de transporte anterógrado en el cimograma apuntan de derecha a izquierda, un ángulo de Feret < 90° indicará un evento anterógrado y >90° un evento retrógrado, de lo contrario será el inverso.

Resultados

Visión general del sistema modelo y del procedimiento de medición
Para visualizar el transporte axonal de los precursores de las vesículas sinápticas, rastreamos endógenamente GFP marcado con RAB-3. Aquí hacemos uso de una cepa⁶ de GFP::Flip-on::RAB-3 recientemente generada, en la que la expresión de la recombinasa Flippasa bajo un promotor específico de la célula (glr-4p) marca RAB-3 endógeno en la neurona motora DA9. DA9 es...

Discusión

Limitaciones del método y métodos alternativos
En este protocolo, optimizamos los parámetros de adquisición para visualizar el transporte axonal de RAB-3 marcado endógenamente, que se asocia con precursores de vesículas sinápticas. Para visualizar el RAB-3, utilizamos una cepa⁶ de FLIP-on::GFP::RAB-3 publicada recientemente y expresamos la flippasa recombinasa bajo un promotor específico de la célula (glr-4p)²⁵....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)