Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

要約

この論文では、生きた線虫の内因性標識カーゴの軸索輸送を単一ニューロン分解能で視覚化するための蛍光顕微鏡取得パラメータの最適化について説明しています。

要約

軸索輸送は、軸索タンパク質をニューロン細胞体内の合成部位から軸索の目的地に送達するための前提条件です。その結果、軸索輸送の喪失は、ニューロンの成長と機能を損ないます。したがって、軸索輸送を研究することで、神経細胞生物学の理解が深まります。CRISPR Cas9ゲノム編集の最近の改善により、軸索カーゴの内因性標識が利用可能になり、異所性発現に基づく輸送の可視化を超えることが可能になりました。しかし、内因性ラベリングは、シグナル強度が低いという代償を払うことが多く、堅牢なデータを取得するための最適化戦略が必要です。ここでは、アクソナルトランスポートの可視化を最適化するためのプロトコルについて、取得パラメータと、拡散性細胞質バックグラウンド上の内因性標識カーゴのシグナルを改善するための漂白アプローチについて説明します。私たちは、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きRAB-3で標識されたシナプス小胞前駆体(SVP)の可視化を最適化するために、当社のプロトコルを適用し、取得パラメータの微調整により 、線虫(C.エレガンス)の内因性標識軸索カーゴの分析をどのように改善できるかを強調しています。

概要

ニューロンは生涯を通じて、タンパク質、脂質、その他の分子を細胞体から軸索の最終目的地に送達するために、軸索輸送に依存しています。その結果、軸索輸送の障害は神経機能の喪失と関連しており、神経変性疾患の病理に関与することがよくあります^1,2。したがって、軸索輸送の根底にあるメカニズムを理解することは、非常に興味深いことです。

軸索輸送に関する数十年にわたる研究により、この輸送を媒介する分子機構、その組成、および調節メカニズムに関する多くの重要な洞察が明らかになりました。長距離の軸索輸送は、微小管細胞骨格上で起こり、これは部分的に重なり合った微小管ポリマーで構成されており、通常は軸索³にプラスエンドが配向しています。その結果、順行性輸送は、微小管のプラス端であるキネシンに移動するモータータンパク質によって媒介されますが、逆行性輸送はマイナス端指向性ダイニンモーターに依存します。輸送の多くの側面が明らかにされていますが、多くの軸索タンパク質については、それらがどのように輸送機構にロードされ、個々の輸送パッケージがどのように組織化され、この輸送がどのように制御されているかはまだ不明です³。

プロトコル

生細胞イメージング用の線虫の維持および調製方法に関する詳細なプロトコルについては、S.Niwa ⁷の研究を参照してください。

1. ワーム株の生成

Caenorhabditis Genetics Center(CGC)⁸ では、線虫株の作製に加えて、ウェブページから直接入手できる蛍光タグ付きタンパク質を内因性に付与した線虫株のコレクションを増やしています。

1. 蛍光標識法の選択
   1. rab-3(ox699)対立遺伝子⁶を含む線虫株MTS1161を用いて、DA9運動ニューロン内のRAB-3と標識された内因性GFPを可視化します(株はCGCに沈着します)。他の軸索タンパク質を可視化するには、Mello Lab⁹のCRISPR Cas9編集プロトコルを使用して、内因性タグ付きタンパク質を持つ線虫株を作製します。
      注:MTS1161は、組換えアプローチを利用して、RAB-3をGFPタグ⁶で細胞特異的に標識します。一般的な代替アプローチは、分割蛍光タンパク質の再構....

ディスカッション

方法と代替方法の制限
このプロトコルでは、シナプス小胞前駆体に関連する内因的にタグ付けされたRAB-3の軸索輸送を視覚化するために、取得パラメータを最適化しました。RAB-3を可視化するために、最近発表されたFLIP-on::GFP::RAB-3株⁶を利用し、細胞特異的プロモーター(glr-4p)²⁵の下で組換えFlippaseを発現させた。この.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)