Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

要約

この論文では、生きた線虫の内因性標識カーゴの軸索輸送を単一ニューロン分解能で視覚化するための蛍光顕微鏡取得パラメータの最適化について説明しています。

要約

軸索輸送は、軸索タンパク質をニューロン細胞体内の合成部位から軸索の目的地に送達するための前提条件です。その結果、軸索輸送の喪失は、ニューロンの成長と機能を損ないます。したがって、軸索輸送を研究することで、神経細胞生物学の理解が深まります。CRISPR Cas9ゲノム編集の最近の改善により、軸索カーゴの内因性標識が利用可能になり、異所性発現に基づく輸送の可視化を超えることが可能になりました。しかし、内因性ラベリングは、シグナル強度が低いという代償を払うことが多く、堅牢なデータを取得するための最適化戦略が必要です。ここでは、アクソナルトランスポートの可視化を最適化するためのプロトコルについて、取得パラメータと、拡散性細胞質バックグラウンド上の内因性標識カーゴのシグナルを改善するための漂白アプローチについて説明します。私たちは、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きRAB-3で標識されたシナプス小胞前駆体(SVP)の可視化を最適化するために、当社のプロトコルを適用し、取得パラメータの微調整により 、線虫(C.エレガンス)の内因性標識軸索カーゴの分析をどのように改善できるかを強調しています。

概要

ニューロンは生涯を通じて、タンパク質、脂質、その他の分子を細胞体から軸索の最終目的地に送達するために、軸索輸送に依存しています。その結果、軸索輸送の障害は神経機能の喪失と関連しており、神経変性疾患の病理に関与することがよくあります^1,2。したがって、軸索輸送の根底にあるメカニズムを理解することは、非常に興味深いことです。

軸索輸送に関する数十年にわたる研究により、この輸送を媒介する分子機構、その組成、および調節メカニズムに関する多くの重要な洞察が明らかになりました。長距離の軸索輸送は、微小管細胞骨格上で起こり、これは部分的に重なり合った微小管ポリマーで構成されており、通常は軸索³にプラスエンドが配向しています。その結果、順行性輸送は、微小管のプラス端であるキネシンに移動するモータータンパク質によって媒介されますが、逆行性輸送はマイナス端指向性ダイニンモーターに依存します。輸送の多くの側面が明らかにされていますが、多くの軸索タンパク質については、それらがどのように輸送機構にロードされ、個々の輸送パッケージがどのように組織化され、この輸送がどのように制御されているかはまだ不明です³。

軸索輸送は、放射性標識アミノ酸を体細胞コンパートメントに注入し、そこで新生の内因性タンパク質に取り込まれ、オート^{ラジオグラフィー4}によって軸索コンパートメント内で経時的に追跡できる放射線標識実験で最初に研究されました。放射性標識実験により、 in vivoでの内因性タンパク質の軸索輸送の研究が可能になりましたが、個々の貨物の挙動を直接追跡してメカニズムの洞察を得ることはできません⁴。この制限は、蛍光顕微鏡の使用によって克服されました。しかし、軸索輸送は、内因性タンパク質では可視化されず、蛍光標識コピーの発現によって可視化されることが多い。特に低発現タンパク質の場合、過剰発現はより高いシグナル強度を提供し、できれば単一ニューロンの分解能での可視化を可能にします。さらに、蛍光タグ付きタンパク質の異所性発現は、ゲノム編集の必要性と課題を回避します。逆に、異所性に発現した貨物の挙動は、内因性貨物^の挙動とは異なる場合があると主張されてきた5。

近年のゲノム編集の改良により、内在性ラベリング戦略へのアクセスが容易になりました。したがって、シグナル強度が低いことは、内因性標識の代わりに異所性発現による貨物の軸索輸送を研究するための主要な制限となっています。内因性ラベリング戦略を慎重に検討し、取得条件を最適化することで、この課題を克服できます。

線虫は、その透明性と遺伝子操作の容易さにより、 in vivo での軸索輸送を研究するための優れた研究モデルを提供します。このプロトコルでは、生きている 線虫 の単一ニューロン分解能で内因性タンパク質の軸索輸送を視覚化する研究戦略について説明します。Jorgensen Lab⁶によって生成された株を使用して、シナプス小胞前駆体の軸索輸送を視覚化します。この株では、小胞に関連するRAB GTPaseであるRAB3が運動ニューロンDA9で内因的にGFPで標識されています。このプロトコルは、さまざまな取得パラメータと光退色における小さな適応が、個々の輸送イベントの視覚化をどのように改善できるかを問うことで、イメージング条件を最適化する方法についてのアイデアを提供します。

プロトコル

生細胞イメージング用の線虫の維持および調製方法に関する詳細なプロトコルについては、S.Niwa ⁷の研究を参照してください。

1. ワーム株の生成

Caenorhabditis Genetics Center(CGC)⁸ では、線虫株の作製に加えて、ウェブページから直接入手できる蛍光タグ付きタンパク質を内因性に付与した線虫株のコレクションを増やしています。

1. 蛍光標識法の選択
   1. rab-3(ox699)対立遺伝子⁶を含む線虫株MTS1161を用いて、DA9運動ニューロン内のRAB-3と標識された内因性GFPを可視化します(株はCGCに沈着します)。他の軸索タンパク質を可視化するには、Mello Lab⁹のCRISPR Cas9編集プロトコルを使用して、内因性タグ付きタンパク質を持つ線虫株を作製します。
      注:MTS1161は、組換えアプローチを利用して、RAB-3をGFPタグ⁶で細胞特異的に標識します。一般的な代替アプローチは、分割蛍光タンパク質の再構成に基づいており、これは、複数の分割蛍光^コピー10を使用することにより内在性タンパク質当たりの蛍光コピー数を増強するため、特に低発現タンパク質に推奨される。コピー数は、CenGenのウェブページ(https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/)¹¹のトランスクリプトームデータセットに基づいて最初に推定できます。
2. 軸索輸送を視覚化するためのニューロンの選択
   1. ひずみMTS1161で、運動ニューロンDA9のRAB-3を視覚化します( 図1を参照)。他の軸索カーゴ、特に低発現タンパク質については、CenGenのウェブページを使用して、分析したタンパク質の発現レベルが最も高いニューロンを特定します。
      注:CenGenプロジェクト(cengen.org)は、線虫の神経系^12,13の302ニューロンすべてを網羅する大規模なトランスクリプトームデータセットに基づいて、線虫の多くのニューロンにおける関心のあるタンパク質の発現レベルを推定するための優れたオンラインリソースを提供する。

2. ワームの取り扱いとイメージングの準備

1. 線虫増殖培地プレートに播種した細菌(株:OP50)を20°Cで播種し、成体期まで1日齢まで成長させた昆虫(株:OP50)の芝生に線虫を飼育してイメージングします。
   注:輸送速度は、異なる軸索貨物、ニューロンクラス、および生物14,15,16,17,18-幼虫期L4または成人期の1日で一貫して老化とともに減少するため、定義された年齢段階での軸索輸送を測定することは重要ですほとんどの論文で使用され、したがって、比較のための最大のデータセットを提供しています。
2. 生細胞イメージング用の線虫の準備:実体顕微鏡で後続のすべてのステップを実行して、線虫を視覚化し、取り扱います。
   1. 白金線ピックを用いて線虫を0.5 mMレバミゾールの液滴に移し、液滴中で線虫を20分間インキュベートする。
   2. ヘアピックを使用して、レバミゾール液滴からの10〜20個の線虫を、スライドガラス上の10%アガロース(M9培地に溶解)パッチ上のM9培地の12μL液滴に慎重にマウントします。10%アガロースパッチの作り方の詳細な手順については、S.Niwa⁷のプロトコールを参照してください。
      注:動物が低酸素症に苦しみ始める前に、スライドごとに数匹の動物しか画像化されないため、線虫の数を少なくするだけで十分です。
   3. 液滴(22 mm x 22 mmまたは18 mm x 18 mm)の上にカバースリップを置きます。DA9軸索でのイメージング輸送のために、軸索をカバースリップの近くに配置します。これを行うには、寒天パッチの上に置いた後、カバースリップを45°回転させて、動物を背中に転がします。
   4. カバースリップとスライドガラスの間のスペースをワセリンのような粘性のあるゲルで密封します。これにより、アガロースパッチが乾燥するのを防ぎ、線虫がイメージングフィールドから漂流する可能性があります。
      注:動物をできるだけ優しく扱うことが重要です。高濃度のレバミゾールまたはワームへの物理的損傷は、軸索輸送を損なう可能性があります。イメージングセッション中の尻尾の軽度のけいれんは、動物が健康な状態を維持していることを示す良い兆候です。動物は健康を保ち、イメージングセッション後にアガロースパッチから回復することさえできます。

3. 生細胞顕微鏡

注:正確な取得パラメータ値は顕微鏡によって異なる場合があります。ただし、各取得パラメータの傾向は、使用する顕微鏡とは無関係である必要があります。このプロトコルでは、漂白用の別のレーザーラインを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用しました(顕微鏡の詳細については 、材料の表 を参照)。緑色蛍光を488 nmレーザーで励起し、ET525/36蛍光フィルターで蛍光をろ過しました。漂白は488nmのレーザーラインを用いて行った。

1. 部屋の温度、または温度制御されたステージが利用可能な場合は、一定の温度に設定されていることを確認します。線虫の場合は、温度を20°Cに設定します。
2. スライドを取り付け、倍率4〜20倍の対物レンズを使用して、スライド上の線虫を特定し、位置を記憶します。画像取得のために63倍倍レンズに切り替えます。
3. 1枚の画像を撮影して、初期取得パラメータを確認します。視野内の信号強度を、アクイジションソフトウェアの強度ヒストグラムで追跡します。強度値は、カメラが検出できる最大信号の下限 3 分の 1 をカバーする必要があります。ピクセルの飽和を避けます。信号強度が低すぎる場合は、励起レーザーの強度を上げます。
   注:タイムラプス中に蛍光タンパク質を漂白するため、励起レーザー強度が高すぎる場合は使用しないでください。
4. ここで取得パラメータと手順を変更して、蛍光シグナル検出を最適化します。
   1. 漂白ステップの実施:漂白ステップの488nmレーザー(出力:15mW)ラインを使用して、分析する軸索の領域を漂白します。漂白効率90%以上を目指してください。漂白ステップの前後の領域の信号強度を比較することにより、漂白効率を決定します。
      注:漂白は、静止した粒子に由来するシグナルと、バックグラウンドのタンパク質の細胞質画分に由来するシグナルを低下させることにより、移動する粒子のシグナルを強化します。シナプス小胞前駆体上のRAB-3などの膜性貨物は、細胞質分画が低いため、漂白ステップは細胞質バックグラウンド上の輸送パッケージのシグナルをわずかに改善するだけです(図2A、D)。ただし、漂白により、個々の輸送イベントの長距離追跡が向上し、一時停止時間を定量化できます(図2A)。
   2. ビニング: 2 x 2 ビニングを使用して、個々のトランスポートイベントの信号強度を強化します。ビニングは、ピクセル配列を 1 つの大きなピクセルに結合します。これにより、空間分解能は低下しますが、個々の輸送イベントの信号強度が向上し、特に薄暗い粒子に役立ちます(図2B、D)。
   3. 露光時間:露光時間を長くして、信号強度を高めます。露光時間を長くすると、サンプルの信号強度が向上し、輸送イベントの時間分解能が低くなります。ここでの実験では、連続する時点間(100〜500ミリ秒の露光時間)で300ミリ秒から700ミリ秒の時間分解能を使用して、RAB-3の個々の輸送イベントを追跡します。(図2C、D)
5. タイムラプス録画:タンパク質のシグナル強度と個々の輸送イベントの頻度に応じて、少なくとも1〜3分のタイムラプスを撮ります。タイムラプスが記録されたら、次の動物に移動します。スライド上の動物は、記録された動物が健康な状態にあることを確認するために、30分を超えて画像化しないでください。
   注:録音中の動物の尻尾の軽度のけいれんは、動物がまだ生きていることを示しています。

4. 軸索輸送データの解析

注:後続の画像分析手順には、ImageJ / Fiji¹⁹ を使用します。フィジーは、すべての一般的な顕微鏡ソフトウェアパッケージでデータを読み取ることができます。

1. キモグラフ生成
   1. データのインポート:タイムラプスデータファイルをフィジーにインポートします。データをフィジーにインポートできない場合は、ソフトウェアパッケージからタイムレコーディングをtiffファイルとしてエクスポートし、後でフィジーにロードします。
   2. ドリフト補正:画像取得中に動物/軸索セグメントが移動したか、わずかにドリフトしたかを確認します。プラグインStackReg²⁰を実行して、動物の動きや漂流を修正します。プラグインを実行するときは、 リジッドボディ 変換を選択します。
   3. キモグラフの手動生成: 図3に詳細なステップバイステップの手順を示します。ドリフト補正動画を利用してキモグラフを生成します。Segmented Line(セグメントライン)ツールを使用し、セグメント化されたラインアイコンをマウスの左ボタンでダブルクリックして、分析する軸索セグメントに沿って線を描画し、軸索の直径に合わせて線幅を調整します。ImageJ/FijiプラグインのKymoreslicewideを実行してキモグラフを生成し、パラメータ設定の線の幅方向の最大強度値を利用します。
      注:線画方向の一貫性を保つ(たとえば、常に近位から遠位軸索または逆方向)と、キモグラフでの後方移動方向をトレースすることが容易になります。
2. トランスポートパラメータの分析
   1. 後続の手順に従って、キモグラフから輸送パラメータ(イベント番号、速度、実行距離、一時停止時間)を計算します。
      1. キモグラフでの輸送イベントのトレース: [直線] ツールを使用して、キモグラフ上の個々の輸送イベントをトレースします。各行をROIマネージャーに保存し、キモグラフですべての輸送イベントをトレースします。ImageJ/Fijiで次の測定パラメータを選択します:面積、バウンディング長方形、平均グレー値、フェレットの直径。
      2. トランスポートパラメータの計算:結果テーブルをスプレッドシートに貼り付け、結果セクションの次の列を使用して計算します。
         ランレングス:幅(ピクセル単位)にカメラの解像度(例:x μm/pxl)を掛けて、ランレングス(μm)をμm単位で決定します。
         Velocity: 実行時間/実行時間。移動イベントの持続時間を秒単位で求めるには、高さ(ピクセル単位)に連続する時間(例:x s/pixel)間の取得時間を掛けます。
         一時停止時間: 速度が 0 の 2 つの連続した動きの間の実行時間。
         イベント番号:イベントの合計をキモグラフの全長に正規化して、分あたりのイベント数と軸索長セグメントを決定できます。イベントは、さらに順行性輸送イベントと逆行性輸送イベントに分類できます。各移動イベントの方向性を決定するには、フェレット角度ツールを使用します。最初に近位から遠位にセグメント化された線を引くことによって生成され、キモグラフの前向性輸送イベントが右から左を指しているキモグラフでは、フェレット角度<90°は順行性イベントを示し、>90°は逆行性イベントを示し、それ以外の場合は逆になります。

結果

モデルシステムと測定手順の概要
シナプス小胞前駆体の軸索輸送を可視化するために、RAB-3と標識されたGFPを内因的に追跡しました。ここでは、最近生成されたGFP::Flip-on::RAB-3株⁶を利用し、細胞特異的プロモーター(glr-4p)の下でのリコンビナーゼFlippaseの発現がDA9運動ニューロンの内因性RAB-3を標識します。DA9は双極性運動ニュ?...

ディスカッション

方法と代替方法の制限
このプロトコルでは、シナプス小胞前駆体に関連する内因的にタグ付けされたRAB-3の軸索輸送を視覚化するために、取得パラメータを最適化しました。RAB-3を可視化するために、最近発表されたFLIP-on::GFP::RAB-3株⁶を利用し、細胞特異的プロモーター(glr-4p)²⁵の下で組換えFlippaseを発現させた。この...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)